Southern 杂交法

以前，用 HindIII 限制性内切核酸酶消化鉴定痕苗病毒 DNA。大部分的外源基因插入重组病毒的 TK 基因中，TK 基因位于 HindIII 5.1 kb 的 J 片段上。这样在重组病毒中，如果插入片段上没有 HindIII 内切酶位点，则J片段就会增大。如果缺乏 HindIII 5.1 kb 的J片段，说明没有污染野生型痘苗病毒。Southern 杂交可以分析提纯病毒的 DNA，也可分析感染细胞的初级裂解物。<link />

生长至汇片的单层 BS-C-1 细胞 重组痘苗病毒储液
完全 MEM-5 和 MEM-10 培养基 PBS 胰酶 低盐缓冲液 蛋白酶K 平衡的苯酚 1:1 苯酚氯仿 TE 缓冲液 乙酸钠 乙醇 HindIII 限制性内切核酸酶和相应缓冲液
12 孔组织培养板

1. 用生长至汇片的单层 BS-C-1 细胞建立用于病毒感染的细胞培养液（见基本方案 1 步骤 1~5）。

2. 用完全 MEM-10 培养基将 2.5 × 10⁵ 细胞/孔放入 12 孔组织培养板培养（每孔终体积为 1 ml），细胞汇片生长（应小于 24 h）。

3. 在使用前，将一定体积的痘苗病毒储液与 0.25 mg/ml 胰酶混合，涡旋混匀。在 37℃ 水浴锅中保温 30 min，并在保温过程中每隔 5~10 min 涡旋混匀一次。

病毒储液的滴度常常在 2 × 10⁹ pfu/ml 左右，但根据其来源的不同病毒滴度也可能低一些。

如果经过涡旋混匀后，还可以看见团状物，将其冷却到 0℃ 并在冰上超声波作用 30 s。可以重复几次超声，但超声的间隔中应当使样品在冰上冷却。

4. 吸出培养基，加入 250 μl MOI 为 10~20 pfu/细胞的完全 MEM-5 培养基，培养 2 h， 每隔 30 min 轻轻摇动培养板，使细胞均匀接触病毒。

5. 加入 1 ml 完全 MEM-5 培养基，培养大约 24 h。

6. 刮下细胞，转移到微量离心管中，最大转速室温离心 30 s，弃培养基。

7. 将沉淀用 50 μl PBS 重悬，涡旋混匀。

8. 在微量离心管中加入 300 μl 低盐缓冲液和 10 μl 的 20 mg/ml 蛋白酶 K，再加入细胞悬液，涡旋混匀， 37℃ 放置 5 h 到过夜。

9. 用等体积苯酚抽提 1 次，再用 1:1 的苯酚/氯仿抽提 1 次。

如果苯酚抽提后，溶液比较黏稠，将其过 25-G 的针头，以剪切 DNA 降低黏稠度。

10. 加入 1/10 体积的 pH 6.0 的 3 mol/L 乙酸钠（终浓度为 0.3 mol/L）和 2.5 倍体积 95% 的乙醇。于冰上放置 30 min 或 -20℃ 放置过夜。

11. 4℃ 以最大转速离心 10 min，弃上清。

12. 用冰浴的 70% 乙醇洗涤，空气中晾干。

13. 用 100 μl pH 7.8 的 TE 缓冲液溶解沉淀。

14. HindIII 限制酶消化 15 μl DNA 溶液，Southern 印迹及杂交分析鉴定。

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1. 所有培养都在加湿的 37℃ 5% CO₂ 培养箱中培养，除非有特殊说明。

2. 与活细胞接触的器械和试剂都应该是无菌的，操作也必须是无菌操作。

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