Southern杂交

Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。

该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替Southern 杂交。但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。

一、基因组 DNA 的制备（前述）

二、基因组 DNA 的限制酶切

　　根据实验目的决定酶切DNA的量。一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。

为保证消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。消化的DNA浓度不宜太高，以0.5μg /μl 为好。由于内切酶是保存在50%甘油内的，而酶只有在甘油浓度<5%的条件下才能发挥正常作用，所以加入反应体系的酶体积不能超过1/10。

具体操作如下：在1.5ml离心管中依次加入

DNA（1μg /μl） 20 μg
10×酶切buffer 4.0 μl
限制性内切酶（10U/μl） 5.0 μl
加ddH2 O 至 500 μl

在最适温度下消化1-3hr。消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。如果消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6hr已没有必要。或者放大反应体积，或者补充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA样品中有太多的杂质，或酶的活力下降。

消化后的DNA加入1/10 体积的0.5M EDTA，以终止消化。然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提，2.5倍体积乙醇沉淀，少量TE溶解（参见DNA提取方法，但离心转速要提高到12000g，以防止小片段DNA的丢失）。

如果需要两种酶消化DNA，而两种酶的反应条件可以一致，则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致，则先用需要低离子强度的酶消化，然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度，再加第二种酶进行消化。

三、 基因组 DNA 消化产物的琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法，制备简单，分离范围广（200bp-50kb），实验成本低。下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的DNA片段范围。

表：不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围

1. 制备0.8%凝胶：一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。

2. 电泳：电泳样品中加入6×Loading 缓冲液，混匀后上样，留一或两泳道加DNA Marker。1-2V/cm，DNA从负极泳向正极。电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时，停止电泳。取出凝胶，紫外灯下观察电泳效果。在胶的一边放置一把刻度尺，拍摄照片。正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带，照片摄入刻度尺是为了以后判断信号带的位置，以确定被杂交的DNA长度。

四、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物

转移就是将琼脂糖凝胶中的DNA 转移到硝酸纤维膜（NC膜）或尼龙膜上，形成固相DNA。转移的目的是使固相DNA与液相的探针进行杂交。常用的转移方法有盐桥法、真空法和电转移法。这里介绍经典的盐桥法（又称为毛细管法）。

（一）试剂准备

１．变性液：0.5M NaOH；1.5 M NaCl。

２．中和液：1M Tris-HCl(pH 7.4)；1.5M NaCl;

３．转移液（20×SSC）： NaCl 175.3g; 柠檬酸三钠82.2g，NaOH 调pH 至7.0，加ddH2 O至1000ml。

（二）操作步骤

1.碱变性:室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。

2. 中和: 将凝胶转移到中和液15min。

3．转移 按凝胶的大小剪裁NC膜或尼龙膜并剪去一角作为标记，水浸湿后，浸入转移液中5min。剪一张比膜稍宽的长条Whatman 3mm滤纸作为盐桥，再按凝胶的尺寸剪3-5张滤纸和大量的纸巾备用。按下图所示进行转移。（ 转移过程一般需要8-24hr，每隔数hr换掉已经湿掉的纸巾。转移液用20×SSC。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物。）

4. 转移结束后取出NC膜，浸入6×SSC溶液数min，洗去膜上沾染的凝胶颗粒，置于两张滤纸之间，80 ° C烘2hr，然后将NC膜夹在两层滤纸间，保存于干燥处。

五、探针标记

进行Southern 杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。这里介绍放射性标记。
探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，有一些试剂盒可供选择，操作也很简单。

以下为Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：

1．取25-50ng模板DNA于0.5ml离心管中，100℃变性5min，立即置冰浴。

2．在另一个0.5ml离心管中加入：

Labeling 5×buffer 10μl
（含有随机引物）
dNTPmix 2μl
(含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mM)
BSA（小牛血清白蛋白） 2μl
[ a -32 P]dATP 3μl
Klenow酶 5U

3．将变性模板DNA加入到上管中，加ddH2 O至50μl，混匀。室温或37℃ 1hr。

4．加50μl 终止缓冲液终止反应。

标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用。由于 a -32 P的半衰期只有14天，所以标记好的探针应尽快使用。探针的比活性最好大于109 计数/分/μl。

六、杂交

Southern 杂交一般采取的是液-固杂交方式，即探针为液相，被杂交DNA为固相。杂交发生于一定条件的溶液（杂交液）中并需要一定的温度，可以用杂交瓶或杂交袋并使液体不断的在膜上流动。杂交液可以自制或从公司购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。下面给出的为一杂交液配方：

PEG 6000 10%；SDS 0.5%；6×SSC；50%甲酰胺。 该杂交液的杂交温度为42℃。

1．预杂交

NC膜浸入2×SSC中5min，在杂交瓶中加入杂交液（8cm×8 cm的膜加5ml即可），将膜的背面贴紧杂交瓶壁，正面朝向杂交液。放入42℃杂交炉中，使杂交体系升到42℃。取经超声粉碎的鲑鱼精DNA（已溶解在水或TE中）100℃加热变性5min，迅速加到杂交瓶中，使其浓度达到100μg/ml。继续杂交4hr。鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点，降低杂交背景、提高杂交特异性。

2．杂交

倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已升温至42℃的杂交液，同样加入变性的鲑鱼精DNA。将探针100℃加热5min，使其变性，迅速加到杂交瓶中。42℃杂交过夜。

七 、洗膜与检测

取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列条件洗膜：
2×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
1×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.5×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.2×SSC/0.1% SDS，56℃，10min；
0.1×SSC/0.1% SDS，56℃，10min。

在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，是洗膜的终止点。上述洗膜过程无论在哪一步达到终点，都必须停止洗膜。

洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水份，并用保鲜膜包裹，注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。将膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏），在暗室的红光下，贴覆两张X光片，每一片都用透明胶带固定，合上暗盒，置-70 ℃ 低温冰箱中曝光。根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天时间。洗片时，先洗一张X光片，若感光偏弱，则再多加两天曝光时间，再洗第二张片子。

影响Southern杂交实验的因素很多，主要有：DNA纯度、酶切效率、电泳分离效果、转移效率、探针比活性和洗膜终止点等。

八、注意事项

1. 要取得好的转移和杂交效果，应根据 DNA 分子的大小，适当调整变性时间。对于分子量较大的 DNA 片段（大于 15kb ），可在变性前用 0.2M HCl 预处理 10min 使其脱嘌呤。

2. 转移用的 NC膜要预先在双蒸水中浸泡使其湿透，否则会影响转膜效果；不可用手触摸NC膜，否则影响DNA的转移及与膜的结合。

3. 转移时，凝胶的四周用Parafilm蜡膜封严，防止在转移过程中产生短路，影响转移效率，同时注意NC膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡，以免影响转移。

4. 注意同位素的安全使用。