如何做好 Southern 杂交？

Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。其基本原理是将待检测的 DNA 样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相 DNA 的位置上显示出杂交信号。通过 Southern 杂交可以判断被检测的 DNA 样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。

该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA 指纹分析和 PCR 产物判断等研究中。但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替 Southern 杂交。但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性 (RFLP) 的检测等。

一、基因组 DNA 的制备（前述）

二、基因组 DNA 的限制酶切

根据实验目的决定酶切 DNA 的量。一般 Southern 杂交每一个电泳通道需要 10-30 μg 的 DNA。购买的限制性内切酶都附有相对应的 10 倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。

为保证消化完全，一般用 2-4 U 的酶消化 1 μg 的 DNA。消化的 DNA 浓度不宜太高，以 0.5 μg/μl 为好。由于内切酶是保存在 50% 甘油内的，而酶只有在甘油浓度 < 5% 的条件下才能发挥正常作用，所以加入反应体系的酶体积不能超过 1/10。

具体操作如下：在 1.5 mL 离心管中依次加入

DNA（1 μg/μl）20 μg

10× 酶切 buffer 4.0 μl

限制性内切酶（10 U/μl）5.0 μl

加 ddH₂O 至 500 μl

在最适温度下消化 1-3 hr。消化结束时可取 5 μl 电泳检测消化效果。如果消化效果不好，可以延长消化时间，但超过 6 hr 已没有必要。或者放大反应体积，或者补充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是 DNA 样品中有太多的杂质，或酶的活力下降。

消化后的 DNA 加入 1/10 体积的 0.5 M EDTA，以终止消化。然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提，2.5 倍体积乙醇沉淀，少量 TE 溶解（参见 DNA 提取方法，但离心转速要提高到 12000 g，以防止小片段 DNA 的丢失）。

如果需要两种酶消化 DNA，而两种酶的反应条件可以一致，则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致，则先用需要低离子强度的酶消化，然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度，再加第二种酶进行消化。

三、 基因组 DNA 消化产物的琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法，制备简单，分离范围广（200 bp~50 kb），实验成本低。下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的 DNA 片段范围。

表：不同浓度琼脂糖凝胶分离 DNA 片段的范围

琼脂糖凝胶浓度（%）分离 DNA 片段范围（kb）

0.3 5-60

0.6 1-20

0.7 0.8-10

0.9 0.5-7

1.2 0.4-6

1.5 0.2-3

2.0 0.1-2

1. 制备 0.8% 凝胶：一般用于 Southern 杂交的电泳胶取 0.8%。

2. 电泳：电泳样品中加入 6× Loading 缓冲液，混匀后上样，留一或两泳道加 DNA Marker。1~2 V/cm，DNA 从负极泳向正极。电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时，停止电泳。取出凝胶，紫外灯下观察电泳效果。在胶的一边放置一把刻度尺，拍摄照片。正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带，照片摄入刻度尺是为了以后判断信号带的位置，以确定被杂交的 DNA 长度。

四、DNA 从琼脂糖凝胶转移到固相支持物

转移就是将琼脂糖凝胶中的 DNA 转移到硝酸纤维膜（NC 膜）或尼龙膜上，形成固相 DNA。转移的目的是使固相 DNA 与液相的探针进行杂交。常用的转移方法有盐桥法、真空法和电转移法。这里介绍经典的盐桥法（又称为毛细管法）。

（一）试剂准备

１．变性液：0.5 M NaOH；1.5 M NaCl。

２．中和液：1 M Tris-HCl（pH7.4）；1.5 M NaCl；

３．转移液（20× SSC）： NaCl 175.3 g；柠檬酸三钠 82.2 g，NaOH 调 pH 至 7.0，加 ddH₂O 至 1000 mL。

（二）操作步骤

1. 碱变性: 室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中 30 min。

2. 中和: 将凝胶转移到中和液 15 min。

3. 转移 按凝胶的大小剪裁 NC 膜或尼龙膜并剪去一角作为标记，水浸湿后，浸入转移液中 5 min。剪一张比膜稍宽的长条 Whatman 3 mm 滤纸作为盐桥，再按凝胶的尺寸剪 3~5 张滤纸和大量的纸巾备用。按下图所示进行转移。（转移过程一般需要 8-24 hr，每隔数 hr 换掉已经湿掉的纸巾。转移液用 20× SSC。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物。）

4. 转移结束后取出 NC 膜，浸入 6× SSC 溶液数 min，洗去膜上沾染的凝胶颗粒，置于两张滤纸之间，80 °C 烘 2 hr，然后将 NC 膜夹在两层滤纸间，保存于干燥处。

五、探针标记

进行 Southern 杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。这里介绍放射性标记。

探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，有一些试剂盒可供选择，操作也很简单。

以下为 Promega 公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：

1. 取 25~50 ng 模板 DNA 于 0.5 mL 离心管中，100 ℃ 变性 5 min，立即置冰浴。

2. 在另一个 0.5 mL 离心管中加入：

Labeling 5× buffer 10 μl

（含有随机引物）

dNTPmix 2 μl

(含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5 mM)

BSA（小牛血清白蛋白）2 μl

[ a -32 P]dATP 3μl

Klenow 酶 5 U

3. 将变性模板 DNA 加入到上管中，加 ddH₂O 至 50 μl，混匀。室温或 37 ℃ 1 hr。

4. 加 50 μl 终止缓冲液终止反应。

标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用。由于 a -32 P 的半衰期只有 14 天，所以标记好的探针应尽快使用。探针的比活性最好大于 109 计数/分/μl。

六、杂交

Southern 杂交一般采取的是液-固杂交方式，即探针为液相，被杂交 DNA 为固相。杂交发生于一定条件的溶液（杂交液）中并需要一定的温度，可以用杂交瓶或杂交袋并使液体不断的在膜上流动。杂交液可以自制或从公司购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。下面给出的为一杂交液配方：

PEG 6000 10%；SDS 0.5%；6×SSC；50% 甲酰胺。 该杂交液的杂交温度为 42 ℃。

1．预杂交

NC 膜浸入 2× SSC 中 5 min，在杂交瓶中加入杂交液（8 cm × 8 cm 的膜加 5 mL 即可），将膜的背面贴紧杂交瓶壁，正面朝向杂交液。放入 42 ℃ 杂交炉中，使杂交体系升到 42 ℃。取经超声粉碎的鲑鱼精 DNA（已溶解在水或 TE 中）100 ℃ 加热变性 5 min，迅速加到杂交瓶中，使其浓度达到 100 μg/mL。继续杂交 4 hr。鲑鱼精 DNA 的作用是封闭 NC 膜上没有 DNA 转移的位点，降低杂交背景、提高杂交特异性。

2．杂交

倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已升温至 42 ℃ 的杂交液，同样加入变性的鲑鱼精 DNA。将探针 100 ℃ 加热 5 min，使其变性，迅速加到杂交瓶中。42 ℃ 杂交过夜。

七 、洗膜与检测

取出 NC 膜，在 2× SSC 溶液中漂洗 5 min，然后按照下列条件洗膜：

2× SSC/0.1% SDS，42 ℃，10 min；

1× SSC/0.1% SDS，42 ℃，10 min；

0.5× SSC/0.1% SDS，42 ℃，10 min；

0.2× SSC/0.1% SDS，56 ℃，10 min；

0.1× SSC/0.1% SDS，56 ℃，10 min。

在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高 1~2 倍时，是洗膜的终止点。上述洗膜过程无论在哪一步达到终点，都必须停止洗膜。

洗完的膜浸入 2× SSC 中 2 min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水份，并用保鲜膜包裹，注意保鲜膜与 NC 膜之间不能有气泡。将膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏），在暗室的红光下，贴覆两张 X 光片，每一片都用透明胶带固定，合上暗盒，置 -70 ℃ 低温冰箱中曝光。根据信号强弱决定曝光时间，一般在 1-3 天时间。洗片时，先洗一张 X 光片，若感光偏弱，则再多加两天曝光时间，再洗第二张片子。

影响 Southern 杂交实验的因素很多，主要有：DNA 纯度、酶切效率、电泳分离效果、转移效率、探针比活性和洗膜终止点等。

八、注意事项

1. 要取得好的转移和杂交效果，应根据 DNA 分子的大小，适当调整变性时间。对于分子量较大的 DNA 片段（大于 15kb），可在变性前用 0.2 M HCl 预处理 10 min 使其脱嘌呤。

2. 转移用的 NC 膜要预先在双蒸水中浸泡使其湿透，否则会影响转膜效果；不可用手触摸 NC 膜，否则影响 DNA 的转移及与膜的结合。

3. 转移时，凝胶的四周用 Parafilm 蜡膜封严，防止在转移过程中产生短路，影响转移效率，同时注意 NC 膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡，以免影响转移。

4. 注意同位素的安全使用。