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Southern 杂交鉴定

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1) 取10μl待测DNA,于一定浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳。(20mL,1.0%凝胶)

2) 凝胶用溴化乙锭染色,切掉凝胶四周多余部分,并在凝胶的一角作一记号, 拍照记录电泳结果(拍照时, 凝胶旁放一尺子)。

3) 杂交用胶的制备 (做以下步骤两组合一)

A. 将凝胶浸没入30mL 0.25mol/L HCl溶液中15min,使DNA脱嘌呤。

B.用蒸馏水短暂洗凝胶2次。

C.将凝胶浸没入30mL变性液中30min, 使凝胶变性。

D.将凝胶浸没入30mL中和液中15min使它被中和。

重复D一次。在制备杂交用胶时准备转移的平台、膜、滤纸等(4、5)。

4) 准备DNA从凝胶向膜转移的平台

5) 将1张待用尼龙膜和3张厚滤纸切成与待转移胶相同大小,并在尼龙膜一角做一标记。

另1张厚滤纸切成与凝胶相同宽度,长度(约18cm)足以达到转移液盒子的底部。

准备10 X SSC 转移液。

将待用尼龙膜用蒸馏水浸湿后,再浸入10 X SSC 转移液中。

6)安装毛细管转移装置

A.将长的滤纸放在转移平台的顶部,滤纸两端达到转移盒的底部,做成虹吸桥。

B.将8 0mL转移液倒入转移盒内,并湿润滤纸。

C.将凝胶背面朝上置于滤纸搭成的桥上,凝胶与滤纸间避免有气泡。

D.用保鲜纸封住凝胶四边。

E.将浸湿的转移膜置于凝胶的上部,凝胶与膜间避免有气泡。

F.将剩下的3张滤纸小心的放在转移膜的上面,并放一叠吸水纸搭在滤纸上,再放一玻璃板,其上压一重物。

G.转移几小时或过夜(至少4小时)

注意:勿使转移液干枯。

7)已转移的DNA与膜交联

A.将膜放在浸有10 X SSC的厚滤纸上,有DNA的一面朝上。

B.将膜置于UV crosslinker 中,在紫外光下自动交联。

C.用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜,空气中干燥。

此膜可在4℃长期保存。

8)DNA探针的制备(略过)

参照生产商提供的实验方法合成地高辛标记的探针。

9)印迹的预杂交

将适量的预杂交液DIG Easy Hyb在42 ℃预热。

放入印迹膜,在42 ℃预杂交30min。

10)准备探针

水煮地高辛标记的探针5min使变性, 并立即放在冰上2min。

11) 加适量的探针到已预热的杂交液中,混合均匀(避免形成泡沫,影响杂交效果)。

42 oC杂交至少4小时或过夜。

注意: 不要将探针直接加在印迹膜上,而应加在容器一角的预杂交液中。

12)印迹膜的冲洗:

A.将杂交液倒出,储存起来可再次使用。

B. 用25mL的2 X SSC,0.1% SDS 在室温摇动洗膜2次,每次5min 。

C. 用已预热的30mL 0.5XSSC,0.1%SDS 在65 oC摇动洗膜2次,每次15min (用杂交炉)。

13)免疫检测:

A. 用10mL冲洗液洗膜1-5min。

B. 膜在15mL阻断液中孵育30min 。

C. 膜和8mL抗体孵育30min。

D. 在15mL冲洗液中洗膜2次,每次15min。

E. 在15mL检测液中平衡2-5min。

14)将膜的有DNA的面朝上,放在保鲜纸上,滴数滴CSPD ready-to-use 覆盖膜; 然后,立即用保鲜纸包裹, 挤掉多余的CSPD ready-to-use,使其均匀平铺在膜上,没有气泡, 但避免使膜干掉. 室温孵育5min。

15)在37 ℃孵育潮湿的膜10min,增强发光。

16)用X-光底片将杂交膜进行曝光10-25min.(发光性能至少可持续48小时)。

17) X-光底片的冲洗。

Agfa 30显影液显影(1-5min)---冲水(1min)---F5定影液定影(10min)---用水冲洗---晾干底片。

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