Southern杂交鉴定方法

1. 取10ul待测DNA，于一定浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳。(20mL，1.0%凝胶)

2. 凝胶用溴化乙锭染色，切掉凝胶四周多余部分，并在凝胶的一角作一记号，拍照记录电泳结果(拍照时，凝胶旁放一尺子)。

3. 杂交用胶的制备 (做以下步骤两组合一)

① 将凝胶浸没入30mL 0.25mol/L HCl溶液中15min，使DNA脱嘌呤。

② 用蒸馏水短暂洗凝胶2次。

③ 将凝胶浸没入30mL变性液中30min，使凝胶变性。

④ 将凝胶浸没入30mL中和液中15min使它被中和。

重复④一次。在制备杂交用胶时准备转移的平台、膜、滤纸等(4、5)。

4. 准备DNA从凝胶向膜转移的平台

5. 将1张待用尼龙膜和3张厚滤纸切成与待转移胶相同大小，并在尼龙膜一角做一标记。另1张厚滤纸切成与凝胶相同宽度，长度(约18cm)足以达到转移液盒子的底部。准备10 X SSC 转移液。

将待用尼龙膜用蒸馏水浸湿后，再浸入10 X SSC 转移液中。

6. 安装毛细管转移装置

① 将长的滤纸放在转移平台的顶部，滤纸两端达到转移盒的底部，做成虹吸桥。

② 将80mL转移液倒入转移盒内，并湿润滤纸。

③ 将凝胶背面朝上置于滤纸搭成的桥上，凝胶与滤纸间避免有气泡。

④ 用保鲜纸封住凝胶四边。

⑤ 将浸湿的转移膜置于凝胶的上部，凝胶与膜间避免有气泡。

⑥ 将剩下的3张滤纸小心的放在转移膜的上面，并放一叠吸水纸搭在滤纸上，再放一玻璃板，其上压一重物。

⑦ 转移几小时或过夜(至少4小时)

注意：勿使转移液干枯。

7. 已转移的DNA与膜交联

① 将膜放在浸有10 X SSC的厚滤纸上，有DNA的一面朝上。

② 将膜置于UV crosslinker中，在紫外光下自动交联。

③ 用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜，空气中干燥。

此膜可在4℃长期保存。

8. DNA探针的制备(略过)

参照生产商提供的实验方法合成地高辛标记的探针。

9. 印迹的预杂交

将适量的预杂交液DIG Easy Hyb在42℃预热。放入印迹膜，在42℃预杂交30min。

10. 准备探针

水煮地高辛标记的探针5min使变性，并立即放在冰上2min.

11. 加适量的探针到已预热的杂交液中，混合均匀(避免形成泡沫，影响杂交效果)。42℃杂交至少4小时或过夜。

注意：不要将探针直接加在印迹膜上，而应加在容器一角的预杂交液中

12. 印迹膜的冲洗：

① 将杂交液倒出，储存起来可再次使用。

② 用25mL的2 X SSC，0.1% SDS 在室温摇动洗膜2次，每次5min。

③ 用已预热的30mL 0.5XSSC，0.1%SDS 在65℃摇动洗膜2次，每次15min (用杂交炉)。

13. 免疫检测：

① 用10mL冲洗液洗膜1-5min。

② 膜在15mL阻断液中孵育30min

③ 膜和8mL抗体孵育30min

④ 在15mL冲洗液中洗膜2次，每次15min。

⑤ 在15mL检测液中平衡2-5min。

14. 将膜的有DNA的面朝上，放在保鲜纸上，滴数滴CSPD ready-to-use 覆盖膜； 然后，立即用保鲜纸包裹， 挤掉多余的CSPD ready-to-use，使其均匀平铺在膜上，没有气泡，但避免使膜干掉。室温孵育5min。

15. 在37℃孵育潮湿的膜10min，增强发光。

16. 用X-光底片将杂交膜进行曝光10-25min。(发光性能至少可持续48小时)

17. X-光底片的冲洗。

Agfa 30显影液显影(1-5min)---冲水(1min)---F5定影液定影(10min)---用水冲洗---晾干底片。