材料与仪器
肿瘤组织
NaCl 溶液 乙醇 TE 缓冲液 小牛胸腺 DNA 标准品 毛细试验溶液 1 X TNE 缓冲液 亚精胺 限制酶和相关的10 X 缓冲液 牛血清白蛋白 6 X 上样缓冲液 HCl 20 X 和 60 X SSC 绯精子DNA 双链 DNA 探针 20% SDS
DNA 提取试剂盒 7. 5 ml圆形玻璃匀浆器或等效物 离心管 水浴装置 大容积pipet 真空泵装置 O 边的螺旋盖管 Rocker 台 荧光计 毛细管 Nitrocellulose 膜 钝头镊子 UV cross-linker 热封聚乙烯袋子 X-AR 放射自显影片子
步骤
![1 5 .在 0. 5^g/m l的溴化乙徒溶液中染胶< l〇 m in ，染胶过程中中度摇动。用 u v 透射照 明器对胶进行拍照。如果D N A 没被破坏，试剂齐全，可接着进行转移。如果D N ^ 有降解，进行差异P C R (备选方案2 ) 对 D N A 进行分析。 16•为了有效地转移> l〇 k b 的条带，把 胶 depurinate到 0. 25m o l /L 的 H C l 中 15〜 30m i n 。对于所有感兴趣的条带，把胶泡在变性试剂中3〇 m i n ，并中度摇动。不要 让胶的表层干燥。把胶泡在复性液中复性30m i n ，并中度摇动。 17.通 过 Southern印记技术在6X S S C 中把D N A 转移到nitrocellulose膜上，转膜时间 为 4h 至 过 夜 （ 附录3G )。用钝头的镊子夹膜。为了对转移后的D N A 进行固定，根 据操作手册把膜放在80°C 真空烘箱或U V cross-linker中烤2h。 带 电 荷 或 不 带 电 荷 的 尼 龙 膜 只 要 在 试 验 程 序 上 进 行 适 当 的 改 变 就 可 以 使 用 。 18•准备好含lmg/m l 鲱精子D N A 的平衡的Quik-H y b 溶液。在固定后的膜与杂交液 一起装进热封聚乙烯袋子，并加入约M O iUl Quik-H y b 溶液/cm2膜 。用热封接器封 住袋子。 65°C ，有摇床的水浴箱中预杂交> l5m m 。 19•对双 链 [Ot-32P] dCTP-标记的探针煮沸约lOmin ( 约 i x i 0 6d p m 探针/ m l QuikH y b )。打开封闭的袋子，加入煮沸的探针。重新封闭袋子让探针在溶液中充分混 匀。 65°C ，有摇床的水浴箱中预杂交1〜2h 。 20.准备三种洗脱液：用 2%3〇 3稀 释 的 2\、 0.5父和0.2\83(：，并加热到55。 (3。从 袋子中取出膜，并依次用以上三种洗脱液洗， 55°C 每 次 2〜5min。膜上没有D N A 的地方不能检测到计数，有的话也很少。对于有150个拷贝的扩增基因的对照，用 Geigercounter (如mini-monitor， P R I ) 至少记录1〇〇 计数/s。单拷贝的对照可记 录 20计数/s。 21•把膜暴露给放射自显影X -A R 膜一段时间，时间的长短根据对照信号的强弱决定 (通常是过夜或12〜14h)。用密度计对膜进行分析。 备选方案1 缝隙杂交技术检测基因扩增 这项技术的优点是只要1〜2jug没降解的D N A ，而且曝光时间只要几小时。然而这 方法在检测低水平的扩增时没有southern杂交的敏感，对扩增的真实水平可能会被 低估。 附加材料（ 基本方案） 3.0m ol/LN aO H ，抽滤灭菌 2.0m ol/L 乙酸铵， pH 7.0, 抽滤灭菌 斑点或缝隙杂父 manifold (如 Bio-Dot S F 、 Bio-Rad or Minifold2，Schleicher & Schuell) nitrocellulose 或尼龙膜 Whatman 3 MM 滤纸 加热灯 1.用描述的方法（ 基本方案，第 1〜9 步）准备肿瘤组织的D N A 。 2. 用单拷贝D N A 对照作为稀释液2 倍稀释扩增的D N A 对照。不要用T E 缓冲液稀释](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/A1470191827150vefud3mnappng_small.jpg)
来源：丁香实验
