概述
Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列,它包括下列步骤: (1) 酶切gDNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。 (2) 将DNA片段转移到固体支持物(正电荷尼龙膜)上。 (3) 预杂交。 (4) 加入探针进行杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。 (5) 显色/X-光片曝光检测杂交信号，即为目的DNA片段。 Southern杂交的成功取决于很多因素, 包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的同源性等。通常，如果将10μg基因组DNA转移到膜上并与探针杂交, Southern杂交可检测出约1pg的单拷贝目标DNA。
注意：本操作方法以所配试剂盒为基础优化形成，应用其它试剂有可能产生不理想结果。
1. 基因组DNA的消化
1. 在标记好的1.5 ml离心管中加入10-15μg gDNA，用灭菌双蒸水调整体积至35 μl。
2. 在1.5 ml离心管中制备酶消化反应液：根据所用的内切酶说明书进行，取15μl消化反应液，与样品混匀后37℃反应过夜。
2. 在1.0%琼脂糖凝胶上分离消化产物
1. 制备1.0%琼脂糖凝胶。
2. 加5 μl 10x loading buffer到45 μl的酶消化产物中。
3. 上样并电泳，45 V，4℃电泳过夜，(注意加DNA分子量标准)，从上样孔计染料前沿约10-12 cm。
4. 在500ml水中加入25 μl 10mg/ml EB，染色，照相记录。
3. Southern印迹
1. 依次用下列溶液处理凝胶,并轻微摇动：0.25M HCl 15分钟，倾去溶液(如果限制性片段>10kb，酸处理时间为20分钟)，用水清洗数次，倾去溶液；变性溶液30分钟，倾去溶液；中和溶液两次,每次15分钟。
2. 用玻板搭建转膜平台，用一张20x SSC饱和的滤纸铺在玻板上，大小要比胶大，将胶置于滤纸上，滤纸左右边缘应各留出2-3cm的边，滤纸和胶之间要注意避免气泡。
3. 剪一张正电荷尼龙膜，大小与胶相当，铺在胶上，膜和胶之间要注意避免气泡。
4. 将3层滤纸用20x SSC湿润，置尼龙膜上，在滤纸上加一叠吸水纸，再盖上一块玻璃板，玻板上加一0.75-1 kg的重物，转移过夜。（如果使用S&S公司的TransBlot,可按说明书进行）
5. 转膜完成后，用铅笔在膜上作好记号，将膜在2x SSC中洗涤20秒钟，置于滤纸上风干。
6. 80℃真空烘烤2小时，或UV交联固定膜上的DNA。
4. 预杂交和杂交
（预杂交或杂交可在杂交袋或杂交炉中进行）
1. 将10-15ml Hyb高效杂交液加入装有膜的杂交管或杂交袋中，68℃预杂交1-2小时，弃去预杂交液。
2. 将400ng Dig标记的探针在95℃变性5分钟，然后快速在冰浴中冷却5分钟。
3. 将探针加到10-15ml 68℃预热的Hyb高效杂交液中，混匀，加入杂交管或杂交袋中，68℃杂交过夜。
4. 倒去杂交液，进行洗膜。
5. 洗膜
1. 室温下，30 ml 2xSSC/0.1%SDS 洗涤2x 5分钟。
2. 65℃，1x SSC/0.1%SDS洗涤2x 15分钟。
6. 检测杂交信号
检测过程在室温下进行，并轻微摇动。
1. 封闭：准备一些大小适当的干净容器，加入30ml 封闭液，用镊子小心地将膜从杂交管（袋）中取出放入容器内，在室温下封闭30分钟。
注意：由于杂交管的弯曲，膜取出后其边缘部分会有卷曲，因此应使膜完全浸入容器底部，以免干燥。我们建议用4-5个大的回形针，将膜固定在容器的底边上，但应注意不要使回形针接触膜上的样品区域。
2. 抗地高辛-AP抗体的制备：每一张膜，用1ml 1×封闭液和1.5μl抗地高辛-AP抗体混匀后，再加入到步骤1的容器中，室温孵育30分钟。(应用化学显色法时，抗体浓度应做调整，约1：5000-10000)
3. 洗膜：除去抗体/封闭液，用40ml 1×抗体洗涤液Ⅰ洗2次，每次洗5 分钟，再用40ml 1×抗体洗涤液Ⅱ重复洗2次，每次洗5 分钟。
4. 信号检测：加15ml 1×检测缓冲液，室温孵育5分钟（确保缓冲液均匀分布在膜上），去掉1×检测缓冲液。
显色法检测：
1. 在10mL检测缓冲液中加入200μl的NBT/BCIP ，混匀，将膜置入显色液中，显色过夜， 约16小时。
2. 终止显色：用灭菌的双蒸水反复冲洗3～5次终止显色。
3. 在成像系统上拍照记录结果。
化学发光法检测：
1. 按比例用1×检测缓冲液稀释CDP-Star化学发光底物，并将底物液均匀加到膜上，室温孵育5分钟。
2. 用扁头镊子将滤膜取出，勿使膜干燥。立即将膜包在塑料膜内，去掉多余的液体和气泡，室温下曝光X光片1-60分钟，建议采用不同的曝光时间，以求得到最佳效果。
7. 相关产品：
正电荷尼龙膜(10 x 15 cm，20 x 30 cm)
Hyb高效杂交液
地高辛/生物素杂交检测试剂盒I(化学显色法)
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(责任编辑：大汉昆仑王)
