小麦Southern杂交分析方法

预杂交液的制备：根据要杂交的膜的数量配制预杂交液，每25 ml预杂交液（1~2张膜）的成分组成如下：

1、取适量小麦基因组DNA，用适量的限制性内切酶消化完全（约5 U/mg DNA，酶切12 h左右），取少量电泳检测酶切完全性；然后依次用酚：氯仿和氯仿：异戊醇抽提，乙醇沉淀。而后溶解在20 ml TE Buffer中；

2、在1%的琼脂糖凝胶上电泳10~12 h，电压为3 V/cm；

3、电泳完毕后，将胶转入EB染色液中，染色10 min，紫外灯下检测酶切结果；

4、将胶转入500 ml 0.25N的HCl中，脱嘌呤15~30 min，直至溴酚蓝变黄，用水洗一下；

5、0.4 N的NaOH处理20 min。与此同时，尼龙膜在超纯水中润湿后，在0.4 N的NaOH中泡5 min以上；

6、将凝胶翻转后放在滤纸桥上，放上一张与凝胶大小相当的尼龙膜（Hybond-N+，Amarsharm），赶除气泡，在膜上放3层滤纸，与尼龙膜大小相同，赶除气泡，将凝胶周围用胶片封好，放上大小相当的吸水纸，压上约500 g的重物，转膜10 h以上，其间更换吸水纸；

7、标记点样孔一角，然后放在2×SSC中浸泡10 min，并进行轻微震荡。用滤纸吸干，保鲜膜包好，置4 ℃存放备用；

8、利用HYBAID固相杂交仪进行预杂交、杂交。杂交瓶中根据膜面积大小，加入10~20 ml预杂交液，预热到65 ℃，然后放入尼龙膜。65 ℃，预杂交5~6 h；

9、采用Takara公司Random primer DNA labeling kit进行探针标记，取适量待标记的DNA片段和Random primer 2 ml，加入ddH₂O至终体积14 ml，95 ℃变性3 min后立即冰浴5 min，瞬时离心。然后在此管中，依次加入：

轻轻混匀，37 ℃反应30 min~1 h。然后65 ℃反应5 min，95 ℃反应3 min后迅速置于冰上冷却；

10、将变性后的探针加到预杂交液中，继续于65 ℃杂交约12 h；

11、用2×SSC/0.5% SDS洗膜液于65 ℃洗膜15 min，重复1次。然后，再用0.2×SSC/0.5% SDS洗膜液于65 ℃洗膜15 min，重复1次；

12、检测杂交信号与背景情况，直至探测器探测的信号为10个counters左右，用滤纸吸干杂交膜，用保鲜膜包好，压磷屏；

13、尼龙膜可以反复进行分子杂交，去除尼龙膜上原杂交探针的方法如下：将0.1×SSC/0.5% SDS洗液加热到100 ℃，放入杂交膜，在大于95 ℃条件下洗5 min，重复3次，将洗好的杂交膜放入2×SSC中漂洗5 min，滤纸吸干，保鲜膜包好，4 ℃存放。