在构建质粒时，菌落pcr的条带都是对的，但是测序结果都是缺少目的基因那一段，这是为什么呢？

可以做个菌液pcr再看看，有很大可能性是连接产物中有剩余目的基因，也可以单扩一个引物看看是不是引物污染，提个质粒跑一下

引物咋设计的？菌落PCR的引物应该一条在插入片段中，一条在载体上，才可以避免假阳性。很可能是因为你做PCR的循环数过大，我们实验室一般对于高拷贝数的质粒，循环数不会超过25个，一般用25个。假阳性出现的原因关键在于做连接的时候加了比较多的目的基因的酶切产物，在转化时，那些没有连接入载体的PCR产物，有的会沾在感受态细胞上，还有的虽然在溶液中，涂板时一起就一起涂在板上了，挑菌的时候可能会挑到，即使没挑到，但菌表面的基因片段也有可能被扩增

1、你的实验目的是什么？ 2、如果是克隆，连接T载体后不用酶切，直接转化菌落pcr检测有目的条带的话送样测序即可。 3、如果是做表达载体构建，pcr产物和质粒DNA酶切后与没有酶切的在同一块胶上电泳，如果两个酶切位点很近，几乎看不到被切下来的小片段条带（太小，早就跑出去了）。你要是怕酶切不完全就多稍微加点酶，切的时间长一点。 4、关于酶切产物有几条带视酶切效果而定，酶切完全则两条，一大一小（小的可能看不到，原因见3、）酶切不完全则三条带，一大一小及未切开的pcr产物；质粒的话可能还多一条环状分子和线状分子的区别。

菌落Pcr假阳性比较多，建议将菌落Pcr阳性的菌液进行质粒提取双酶切鉴定，有条带再行测序比较稳妥。菌落Pcr假阳性多可以换一对引物试试

你菌落pcr用的primer是你插入目的基因的primer，还是你载体的primer，如果直接用插入基因的primer，很容易出现假阳性的。

建议重新以菌落为模板进行PCR检测，再重新以菌液为模板进行PCR检测，因为菌落或者菌液PCR假阳性的几率还是比较高的。

菌落pcr的假阳性很多，也有很多原因，所以一般都是需要测序结果佐证的。
1，引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
2，靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出 PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。