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克隆与构建
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问
同源重组克隆时序列GC含量过高，一直连不进去，有什么办法可以改善这个问题吗？
dxyc42u
使用GC buffer我们实验室有人搞出来的
3 回答
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问
构建稳转细胞系
dxyc42u
没高表达低表达之分，pcDNA3.4可以构建稳转株的
3 回答
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问
T载体如何构建？直接买试剂盒好不好？怎么操作？可以连4K以上的基因吗？
Dr_劉医生
4K的片段太大了，建议找公司外包帮你构建载体，不然失败风险太高，而且很费时，耽误实验进度
3 回答
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问
分子克隆PCR没有目的条带只有引物二聚体，救救孩子吧
loveliufudan
下面是一些可能的原因：1.引物设计问题：如果引物设计不当，可能会导致二聚体的产生而不是目的条带。2.PCR条件问题：如果 PCR 条件不当，例如温度过高或过低，可能会导致二聚体的产生。3.模板 DNA 量问题：如果模板 DNA 量过少或过多，可能会导致 PCR 不成功。4.污染：实验过程中的污染也可能会导致 PCR 不成功。对于这种情况，可以尝试重新设计引物，调整 PCR 条件，确保模板 DNA
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问
pcr克隆问题请教
土井挞克树
上样量的问题，看不到目的条带可能是存在裂解。
4 回答
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问
求问pD-Sred质粒完整图谱，用于构建慢病毒载体。
土井挞克树
我给你发了一张图谱来给你参考。
2 回答
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问
构建miRNA过表达载体问题
dxyc42u
我一般是分别构建成熟mirna的
3 回答
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问
克隆基因
土井挞克树
结果区是灰色，说明没有结果产生，可能是样本问题可能是设置参数问题
3 回答
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问
小片段DNA50-60bp左右，用酶切法构建质粒，有什么缺点？比如酶切，回收，纯化有什么限制，相较于300bp以上的来说？
汤姆卜丽波
小片段限制很多，首先酶切不均匀就不好切，还有就是片段小跑胶不容易跑出来，回收也很容易漏掉，建议你在片段左右两边添加一些序列
3 回答
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问
构建重组载体转化大肠后测序，序列总有突变，可以从那些方面分析原因？
bamboopiggy
首先把你的模版拿去测序，我遇到过因为模版有问题，结果怎么改条件都不行。2.如果实在不行，设计引物，把突变的地方再给它突变回来。我当时就是发现模版也有mutation，只能自己给它纠正回来
3 回答
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问
pet28a为载体的质粒转化后在kana平板上长出单克隆，挑菌摇菌长不出来怎么回事
bamboopiggy
你用多大体积摇的？一般先用3ml摇过夜吧？确定没有放错kana？还有你转速有点太快了，降到250，摇过夜试试
4 回答
1456 围观
问
以质粒为模板的pcr克隆线性化载体pcr不出来怎么办
天一湖医者
如果你以质粒为模版扩pcr,然后跑胶时还能看到质粒的条带，那说明你的模版量太大了。降低模版量至最多20ng应该可以了，一般我实验中都用1－10ng就够了，而且这还是50ul体系，如果你的体系更小，我想最多1ng就够了
3 回答
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问
PCR 检测阳性，酶切无带的克隆，测序是否有结果？
tao0129
这种情况下，最好不要送去测序，最好重新做连接。当然这种情况的出现有一种可能是细菌培养时间过长，导致质粒被甲基化修饰所造成的。此时，你只需重新培养细菌，重新提取质粒即可。但这种情况的出现，还有一种可能是PCR假阳性，尤其是在克隆片段较短时会出现。那么这时，你只能重新做连接。建议：干脆重新做连接还比较放心。注意：你的片段比较小，你酶切后的片段浓度能否在电泳后出现带，这一点你一定要弄清，你必须保证浓度酶
1 回答
3241 围观
问
求助/质粒转化后挑单克隆送检测序无信号，什么原因？
balalaLy
这种情况蛮常见的，可能就是长的杂菌。又或者挑单克隆后摇菌时间不够，或者送测序前的菌活性就不行。我试过第一次送测序没有信号，同一管菌液第二次送测序结果对的
3 回答
4133 围观
问
做克隆，挑好菌37度下摇菌摇不出来是怎么回事呢？
huarenqiang5
说明转化不成功，可能是SDS污染或噬菌体污染导致。
3 回答
2266 围观
问
杂交瘤细胞第二次亚克隆没有阳性了，但是用第一次亚克隆的上清却有荧光
huarenqiang5
正常情况下，杂交瘤不是绝对稳定的，容易发生染色体丢失的情况，尤其是当细胞移到新环境中生长，如从小孔扩大到大孔，或者复苏操作时，更容易发生阳性变为阴性。但是也有一些方法尽量减少阳性变为阴性。一般可以从这几个方面加以注意： 1.尽量使细胞处在最佳的生长环境中。尤其是培养基不能长期不换，一般而言，当细胞增长到一定密度时，培养基就开始变颜色，此时就要准备换培养基。除换培养基，同时应该控制好细胞
2 回答
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问
质粒构建整个流程和软件
juyue2010
snapgene软件不错，简单易学，功能齐全
6 回答
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问
细菌质粒构建如何确保准确
天一湖医者
保存质粒用的菌宿主需要小心选择，因为有不少菌株已经工程化，有些缺失了某些纠错系统，有些则还保留着重组体系。典型的是最好不要用表达载体保存质粒，如BL21(DE3)就不适合，由于其没有缺失重组酶RecA。具体可以看各菌株的基因型。常用于保存质粒的菌株有DH5a, XL1-blue, TOP10等。
4 回答
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问
在构建质粒时，菌落pcr的条带都是对的，但是测序结果都是缺少目的基因那一段，这是为什么呢？
汤姆卜丽波
可以做个菌液pcr再看看，有很大可能性是连接产物中有剩余目的基因，也可以单扩一个引物看看是不是引物污染，提个质粒跑一下
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问
质粒构建技术过程中遇到的问题？
Junego
质粒提取的试剂盒已经很普遍了，主要是碱裂法+吸附柱，按照试剂盒说明书就可以。抓住一下关键的点：1.菌液新鲜制备：最好挑单菌落培养，4h左右活化后，再接种到试管中过夜培养。2.裂解要充分：菌液和裂解液有一定比例的，不要加太多菌，5mL菌获得的质粒足够克隆用很久（一般可以获得5-10μg）。3.质量控制：看产量和纯度，用Nanodrop定量。纯度的话，OD260/280为1.8-2.0，OD260/2
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