杂交瘤细胞第二次亚克隆没有阳性了，但是用第一次亚克隆的上清却有荧光

正常情况下，杂交瘤不是绝对稳定的，容易发生染色体丢失的情况，尤其是当细胞移到新环境中生长，如从小孔扩大到大孔，或者复苏操作时，更容易发生阳性变为阴性。但是也有一些方法尽量减少阳性变为阴性。一般可以从这几个方面加以注意：

　1.尽量使细胞处在最佳的生长环境中。尤其是培养基不能长期不换，一般而言，当细胞增长到一定密度时，培养基就开始变颜色，此时就要准备换培养基。除换培养基，同时应该控制好细胞密度，可以吹走过多的细胞，使新加入的培养基不至于很快被消耗。

2.对于重要的细胞株，每一步都把阳性的细胞保种。

　3.不要频繁操作细胞，当细胞生长密度不是很大时，不要频繁操作，否则细胞容易出现死亡或者生长形态发生明显变化。

　4.对于传代次数较多的细胞株需要经常进行亚克隆，并将每一次的亚克隆株也作冻存。

　5.当细胞被支原体微生物污染，也会发生由阳性转为阴性的情况。

考虑是克隆过程的问题，克隆过程可能出现变异。