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以质粒为模板的pcr克隆线性化载体pcr不出来怎么办

相关实验:间接原位 PCR(原位杂交PCR)

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ColaFJYF

如题,质粒用的是从DH5α中提取出来的转化后的索来宝Pet-32a质粒。浓度为132ng/ml。现在想做同源重组,以质粒为模板做的载体线性化克隆pcr选取的酶切位点是ecor1和hind3。总共5900bp,用的vazyme p515 mix

50ul体系:

dd水 20.5ul

上下引物 (10um)2ul

质粒模板 0.5ul

mix 25ul

反应程序

预变性 95℃ 30s

变性 95℃ 15s

退火 58℃ 10s

延伸 72℃ 6min

彻底延伸 72℃ 5min

之后用dnp1 2ul37℃处理15分钟

有一次做温度梯度实验时10ul体系做的发现58℃有条带很暗但是单一正确。再做50ul体系进行胶回收发现一直扩增不出来结果如图所示。也不知道是什么原因。已经p了2个星期了。。。

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3 个回答

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dxy_kg0gr2v5

有帮助

你这个问题我也遇到过,首先去设阳性跟阴性对照,确保载体跟模板没有问题,如果实在不行,建议传统克隆试一下

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Eason老歌迷

有帮助

做好对照,然后确保你的引物和酶没有啥问题,基本上就OK了

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天一湖医者

有帮助

如果你以质粒为模版扩pcr,然后跑胶时还能看到质粒的条带,那说明你的模版量太大了。降低模版量至最多20ng应该可以了,一般我实验中都用1-10ng就够了,而且这还是50ul体系,如果你的体系更小,我想最多1ng就够了

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