求助｜茎环法miRNA做RT-PCR内参和目的基因CT值差距大

楼主用茎环法做miRNA的RT-qPCR，U6做内参。

逆转录的时候，如果miRNA的茎环逆转录引物和U6的后引物1:1的话，做PCR的时候miRNA和U6的CT值分别在30和10左右，差距过大；

后来楼主逆转录的时候把逆转录引物调成1.9:0.1，做PCR时miRNA和U6的CT值还是在28.29和15.16左右；

后来楼主又把引物比例调成了2:0，直接没加U6的逆转录引物，做PCR出来，miRNA的CT值28.29，U6的CT值22.23。

稀释倍数已经调过了，上面是最好的结果，但还是不够理想，目前是希望两者的CT值再缩小一些，主要是想把内参的CT值调大一些，这样稀释倍数调浓一些就可以把目的基因的CT值调小。

但是逆转录的U6的引物已经调的很低了，甚至不加（不加是否可行）。

问题：

1.楼主的miRNA茎环逆转录引物的Tm是74，U6后引物的Tm在59，我进行逆转录时的温度是42，是否是因为两者的Tm值过大导致miRNA逆转录效率低，该怎样调整逆转录条件？

2.楼主逆转录时不加U6的逆转录引物，这样是否可行？

3.查资料看到可以把U6的逆转录引物换成Random 随机引物，它和miRNA的茎环引物比例要怎么设置？

4.考虑到楼主的miRNA含量较低，是否需要换成专门的miRNA提取及逆转录和PCR的试剂盒？（最好不换，有别的方法最好）

【楼主用promega的trizol做总RNA提取，用promega的逆转录试剂盒和qPCR预混液做逆转录和qPCR】