PCR/RT-PCR指南---PCR产物克隆

互联网2013-12-26

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PCR 克隆主要有TA克隆法, 限制性酶切与连接法，杂交法和近期开发出来的特异性重组法等。

但因为TA克隆法操作最简单，快速和高效的原因，成为Taq聚合酶PCR 产物的最佳克隆方法。TA克隆法由Invitrogen发明，并拥有全球TA Cloning商标的专利权。

TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）

利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR 扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。Invitrogen公司TA克隆系统和Topo TA克隆系统都提供一个线性含3`-T突出端的载体用于直接高效地连接PCR 产物。系统中也包含感受态细胞和S.O.C培养基, 使得实验操作更为简单方便。

所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将PCR 产物进行优化，不需把PCR 产物做平端处理（Invitrogen另有平端载体供高确限度酶克隆）。不需在PCR 扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。

图32 The TA Cloning® Concept

Topo TA克隆方法（Topo TA Cloning Kit）

Topo TA克隆原理与TA克隆一样，唯一不同的是TA克隆用的是T4连接酶把PCR 片断连接到T载体上，而Topo TA Cloning用的是DNA Topoisomerase。

Topoisomerase的用途一般使用在复制DNA前把超螺旋DNA切割使之解旋后，再连接成线性DNA。

Topo TA克隆即使用Topoisomerase高效连接的特性把含3`A端的PCR 扩增片断快速连接到3`T端载体上，整个反应只需五分钟！一般T4连接酶需过夜才能高效连接。Topo TA克隆系统提供Topoisomerase I载体，感受态细胞，SOC培养基等。

1. Add 1ml of TOPO® Cloning vector to 1ml of the Taq-amplified PCR product		2. Incubate for 5 minutes on your bench top		3. Transform One Shot® Competent E. coli.

Topo平端克隆方法和长PCR 片断克隆法（Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit）（Topo XL PCR Cloning Kit）

因为越来越多高确限度热稳定酶如Pfx、Pfu被用于PCR 扩增，使到PCR 后都只是平端产物。这种平端克隆往往效率低，并且有非特异性背景菌落产生，造成筛选困难。

Topo平端克隆主要改良载体设计，把ccdB （Control of cell death）基因并入到mcs中，如果没有DNA片断插入，ccdB基因则会表达，ccdB基因的表达蛋白，会破坏细菌的DNA gyrase，造成细菌染色体的降解导致细菌死亡。如果有插入片断，则ccdB基因表达受到阻碍，所以细胞可生长。这样可以把高背景的缺点改善，节省筛选的时间。Topo平端克隆与Topo TA方法一样，操作简单快速。

平端PCR 克隆方法（Zero Blunt PCR Cloning Kit）

Zero Blunt PCR 克隆乃利用传统T4连接酶方法，但载体和Topo平端的一样，含ccdB基因，所以同样可降低菌落背景，易于筛选。

表10 PCR 克隆试剂盒的选择
Amplification Enzyme	Application of Cloned PCR Product	Ligation Method	Product	Advantages	Cat. No.
Taq DNA Polymerase	•Sequencing •Safeguarding sample •In vitro transcription	TOPO® Cloning(5 minutes) Topoisomerase	TOPO TA Cloning® Kit	•≥95% recombinants	K4500-01 K4550-01 K4560-01
•Blue/white color screening
TOPO TA Cloning® Kit Dual Promoter	•≥95% recombinants	K4600-01 K4650-01 K4660-01
•Blue/white color screening
•Dual Sp6 and T7 promoter primer sites for in vitro transcription
TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing	•≥95% recombinants	K4575-01
•Streamlined sequence analysis
Ligase-mediated(overnight)T4 DNA ligase	Original TA Cloning® Kit	•≥80% recombinants	K2000-10 K2030-10
•Blue/white color screening
Original TA Cloning® Kit Dual Promoter	•≥80% recombinants	K2050-01 K2060-01
•Blue/white color screening
•Dual Sp6 and T7 promoter/primers sites for in vitro transcription
TOPO® Cloning(5 minutes) Topoisomerase	Various	•Fast cloning directly into an expression vector	All the TOPO Exp. Kits
Proofreading polymerase高确限度酶	•Expression of cloned PCR product	TOPO® Cloning(5 minutes) Topoisomerase	Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit	•≥95% recombinants	K2800-20
•Positive selection resulting in low background
Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit for Sequencing	•≥95% recombinants	K2875-20
•Positive selection resulting in low background
•Streamlined sequence analysis
Ligase-mediated(1 hour)T4 DNA ligase	Zero Blunt® PCR Cloning Kit	•≥95% recombinants	K2700-20
•Positive selection resulting in low background
Polymerase mixturesfor long Template混合酶	•Sequencing •Safeguarding sample •In vitro transcription	TOPO® Cloning(5 minutes) Topoisomerase	TOPO® XL PCR Cloning Kit	•High-efficiency cloning of long (3-10kb) PCR products	K4700-10
•Positive selection resulting in low background

TOPO PCR 表达克隆法

传统限制酶切法必须把目标片段切下来再连接至表达载体上，这会导致一些非原始蛋白的其他氨基酸也混在其中，从而影响蛋白表达和蛋白的功能。利用TOPO克隆技术把PCR 产物直接克隆至表达载体，则可避免这种情况。

Comparison of Cloning Strategies

TOPO PCR 表达克隆法仍利用特异引物把目标基因PCR 扩增后，再利用高效的Topoisomerase 酶把产物快速连接到T表达载体上，这是到载体上的目标基因不含非编码区，Invitrogen提供了原核细胞、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞的各种PCR 克隆表达系统。

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