PCR产物的平末端克隆

靶基因经 PCR 扩增，样品进行必要的纯化回收后，接下来用平末端进行连接克隆也是分子生物学实验中常规采用的技术路线，实验一般利用噬菌体 T4 DNA 聚合酶等补平扩增 DNA 片段的末端（Weiner 1993; Chuang et al. 1995)。Liu 与 Schwartz (1992) 发现在连接反应的温育过程中，当反应液中存在过量的限制性内切核酸酶能显著地增加重组质粒的产率。这种内切核酸酶的作用在于切割环状的和线性的串联体，而 这种内部的酶切位点是由质粒分子自连产生的。这种方法要求靶 DNA 分子与载体的连接消除其限制性酶切位点。在这个过程中还必须防止内切酶消化连接反应产生的重组子。在连接反应中，单位长度的线性载体分子不断产生（或再 生）的净效应将驱使连接反应的平衡态向有利于载体与插入片段连接产生重组子的方向进展。

噬菌体 T4 DNA 连接酶 噬菌体 T4 DNA 聚合酶 限制性内切核酸酶 闭环质粒 DNA 靶基因 DNA
ATP dNTP 溶液 KGB 广域缓冲液
琼脂糖凝胶 水浴箱

一、材料

1. 缓冲液与溶液

10 mmol/L ATP

2 mmol/L dNTP 溶液（含四种 dNTP）

10X KGB 广域缓冲液（1 mol/L 乙酸钾，250 mmol/L Tris-acetate ( pH 7.6 )，100 mmol/L MgAc ( 含四水化合物），5 mmol/L β-巯基乙醇，100 μg/ml 牛血清白蛋白）

2. 酶与缓冲液

噬菌体 T4 DNA 连接酶

噬菌体 T4 DNA 聚合酶

用于克隆的限制性内切核酸酶

限制性内切核酸酶

3. 凝胶

琼脂糖凝胶

4. 核酸与寡核苷酸

闭环质粒 DNA ( 50 μg/ml）

靶基因 DNA ( 25 μg/ml) 及 PCR 扩增产物

5. 特殊设备

水浴箱预设水温在 22℃

二、方法

1. 在一只微量离心管内，依次加入下列试剂，混匀：

50 μg/ml 闭环质粒载体      1 μl

25 μg/ml PCR 扩增靶 DNA 8 μl

10X KGB 广域缓冲液         2 μl

H₂O( 见下面注释）           5 μl

10 mmol/L ATP                1 μl

2 mmol/L dNTP                1 μl

限制性内切核酸酶            2 单位

T4 DNA 聚合酶                1 单位

T4 DNA 连接酶                3 单位

注意：用 H₂O 调整终反应体积为 20 μl 反应体系。

设置对照反应管，加入以上除了 PCR 扩增靶 DNA 的所有试剂。

2. 将连接反应混合液离心管在 22℃ 水浴温育 4 h。

3. 将上述两支试管内的连接反应混合液样品各取 5 μl，用 10 μl H₂O 稀释后，转化具有抗生素抗性的感受态大肠杆菌受体菌。将这种转化菌液涂布于含适当抗生素和 IPTG 与 X-gal 的培养基的平皿上。

4. 计算实验管与对照管在培养皿上的菌落数。

挑取可能含有靶基因 DNA 插入片段的白色单菌落进行培养扩增，抽提质粒 DNA，利用质粒多克隆位点内的插入外源 DNA 片段侧翼的酶切位点，用相应的限制性内切核酸酶进行酶切鉴定；也可以用菌落 PCR 予以鉴定。

5. 通过琼脂糖凝胶电泳测定克隆 DNA 片段的大小（采用合适的 DNA marker 分子量作对照）。

6. 利用 DNA 序列分析、限制性内切核酸酶图谱或 Southern 杂交进一步鉴定克隆的靶基因 DNA 片段的正确性。