质粒构建技术过程中遇到的问题？

质粒提取的试剂盒已经很普遍了，主要是碱裂法+吸附柱，按照试剂盒说明书就可以。抓住一下关键的点：

1.菌液新鲜制备：最好挑单菌落培养，4h左右活化后，再接种到试管中过夜培养。

2.裂解要充分：菌液和裂解液有一定比例的，不要加太多菌，5mL菌获得的质粒足够克隆用很久（一般可以获得5-10μg）。

3.质量控制：看产量和纯度，用Nanodrop定量。纯度的话，OD260/280为1.8-2.0，OD260/230为2-2.4。

质粒提取如果效果一直不好，建议直接买试剂盒提取，商业化质粒提取试剂盒提取效果还不错。

是不是菌液量不太够，一般质粒小提取至少要菌液14-16h，1-5ml

首先要看菌液量以及浓度够不够。如果都够了，p1RNA酶是否有效或者是不是p2裂解有问题，p2p3 加入后一定要轻轻翻转，然后吸附柱先平衡，洗脱时可以倒回再洗一次看看会不会好一点

这个问题，可能是很多原因导致的。比如说，洗脱时间过短，洗脱液不合适。使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低。使用过多菌体培养液，菌体裂解不充分。 质粒没有全部溶解。等等

质粒构建、转化之后有没有进行验证？一般是转化长出单克隆后送测序，测序对了的话后续扩增和提取一般很少会出现问题。

是不是你感受态有问题了？还是你的质粒是低拷贝的？建议重新转化，可能会提高质粒的产量。至于质粒的纯度，因为你产量低，纯度不会好，等产量上去了，纯度就会好。

可能有以下原因：

1 ) 大肠杆菌老化：

请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

2 ) 质粒拷贝数低：

由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA 提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体 。

3 ) 菌体中无质粒：

有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此，不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落，另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

4 ) 碱裂解不充分：

使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分。

5 ) 吸附柱过载：

不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。

6 ) 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时)：

洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

7 ) 乙醇残留：

漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。

8 ) 洗脱液加入位置不正确：

洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。

9 ) 洗脱液不合适：

DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如，洗脱缓冲液EB(10mM Tris•Cl，pH8.5)或水。洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH7.0～8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。

细菌老化；细菌培养物生长过度或不新鲜；质粒拷贝数低；菌体过量，碱裂解不充分；取样时菌液过多，导致菌体裂解不充分；溶液使用不当 ；洗脱液加入位置不正确等原因都可引起。应注意改进！

使用过多的菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，此时可减少菌体用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液P1、P2和P3，可能有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。

质粒提取率低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。