质粒构建中，怎么在质粒上给基因加A尾？

平末端DNA加A的步骤一般是先纯化PCR产物，加入dATP Buffer，利用Taq 酶在平末端片段后加上A尾后才能与T载体的T头互补连接TA克隆。

用 T载体，先连然后再酶切连到你需要的载体上

有平末端连接试剂盒或者加A试剂液，购买即可，相当方便

有两种方法，看你用的是什么酶：（1）使用不同的Taq酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃ 10分钟一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在扩增产物的3末端加上A，得到的DNA序列为钝端，因此，需要在回收纯化后进行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分钟

有两种平末端DNA加A尾方法,一种是切胶回收后加,另一种是直接加在PCR产物中

1.保守法，先对平末端PCR产物纯化后，浓度要求至少20ng/ ul（大概就好，跑胶图像条带清晰，明亮），取14.5 ul PCR产物，加入2 ul Taq Buffer，3ul dNTP，0.5 ul Taq酶，在72度反应10~20min, 后直接回收纯化加A尾的DNA片段可用于TA克隆，此方法操作容易，成功率高；

2.快速法，高保真酶PCR后的管子（体系为50ul）不用先纯化直接加入3ul dNTP 和0.5 ul Taq酶继续72度反应10~20min，此后直接回收或跑胶回收纯化加A尾的DNA片段可用于TA克隆，此方法操作步骤较少和方便，节省实验时间和实验经费。