实时定量PCR测定组织和细胞内miRNA丰度

由于成熟miRNA的长度仅为约22nt,无法进行PCR扩增反应．所以在进行该法检测之前，要对所提取的miRNA进行结构上的处理。一般的做法是在成熟miRNA的一端连接上一段已知序列的核苷酸，经反转录后，再以此为模板进行后续的PCR扩增。目前常用的是茎环法和加尾法。

实时定量PCR测定组织和细胞内miRNA丰度中茎环法的基本原理是在miRNA成熟序列的3'-端加上一段茎环序列，茎环尾部的6-7个碱基能够与miRNA的末端互补结合（图18-2)，为模板序列的合成提供羟基。在反转录酶存在的情况下，以miRNA的成熟序列为模板进行反转录，形成一段包含miRNA及茎环结构的序列。这增加了miRNA的核苷酸序列，使PCR扩增成为可能。加尾法在定量PCR前，先在成熟miRNA的3'-端加上一段多聚A尾，并用5'-端带有40nt错定序列的Oligo(dT)引物进行反转录，使得样品中所有的miRNA均被延伸（图18-2)。

实时定量PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。

器材：

研磨仪、PCR仪。

试剂：

实时定量PCR的基本过程可分为如下几步：

（一）引物和探针的设计

检查比对序列，先选择好探针的位置，然后设计引物使其尽可能地靠近探针。

探针的设计原则是：

①尽可能短，不要超过30 bp;；②Tm值应在68-70 ℃之间；③避免5'-端是鸟苷酸（G），以免发生淬灭作用；④选择胞苷酸（C）多于鸟苷酸（G）的链作探针，G的含量多于C会降低反应效率。

（二）动物组织／细胞总RNA的抽提及检测（TRIzol法）

A. 取新鲜动物组织0.1~0.2 g置于研钵中，用剪刀剪碎组织，研钵中加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，成粉末状，每100 mg组织加入1 ml TRIzol，在冰浴中迅速匀浆15~30 s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一微量离心管中，室温下静置5 min。

B. 若为贴壁细胞，培养预定时间后，彻底弃掉培养液。将TRIzol试剂直接加在贴壁细胞上，室温放置10 min；若为悬浮培养细胞，则直接离心收集细胞后用TRIzol重悬、裂解，每1 ml TRlzol可裂解5x10⁶个动物、植物或酵母细胞，或1X10⁷个细菌菌体。

C. 反复吹打裂解组织／细胞，裂解液移入新管，室温静置5 min，4 ℃、12000 g离心10 min。

D. 将上清转移入新管，按照TRIzol：氯仿等于5:1的比例加入氯仿200 µl，用力颠倒充分混匀，静置10 min，待其分层后，4 °C、12000 g离心15 min。

E小心转移水相至新管中，加入等体积异丙醇，振荡混匀，室温放置10 min，4 ℃、12000 g离心10 min，小心弃上清。

注意事项：

RT-PCR实验的成败在很大程度上取决于RNA的纯度和完整性。利用动物组织／细胞提取RNA时，要利用高浓度的蛋白质变性剂以及酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离。

在提取的过程中要抑制内源和外源的RNA酶（RNase）活性，保护RNA分子不被降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行，配制RNA提取试剂要用焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）处理过的水以去除残余的RNA酶。

（三）茎环法RT-PCR反应

A. 反转录

在微量离心管中加入模板RNA 2 µg，Oligo（dT）18（0.1 µg/µl）5 µl，10 mmol/L dNTP 2 µl，DEPC水补足体积至14 µI，65 °C水浴5 min，立即放到冰上，顺序依次加入：

37 ℃孵育60 min。

B. PCR反应

DEPC水 37.5 µI

扩增程序：

94 ℃ 5 min热启动；94 °C 45 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 °C 10 min。

注意事项：

RT-PCR中的关键步骤是RNA的反转录，然后核糖核酸酶H（RNaseH）催化DNA-RNA杂合体的RNA部分降解。未除净的蛋白质可与RNA结合从而影响反转录和PCR反应。若RNA模板中污染了微量DNA，扩增后会出现非特异DNA的PCR产物。

（四）加尾法RT-PCR反应

A. 加尾反应。冰上配制以下体系：

B. 轻弹混匀反应混合物，短暂离心后置于37 ℃反应30 min，并于95 ℃反应5 min灭活酶，所得产物可立即进行cDNA第一链合成，也可于-20 ℃保存。

C. 将10 µl（1 µg）polyA加尾处理后的RNA加入无RNA酶的微量离心管中，并于65 ℃温育5 min，反应完毕立即置于冰上。

D按下表顺序配制反转录反应体系：

E. RT反应：轻弹混匀反应混合物，短暂离心后置于42 ℃反应1 h，反应结束后于95 ℃加热5 min终止反应，获得的cDNA 稀释后可直接用于而RNA的检测。

（五）PCR数据分析

一般而言，荧光扩增曲线可以分成3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期，其形状是一条平滑的"S"形曲线。

1. 标准曲线法的绝对定量 用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线。标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的单链DNA。

2. 标准曲线法的相对定量 属于自身相对标准曲线。所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样品靶序列的量来自于自身标准曲线，最终必须除以参照物的量。

3. Ct比较法的相对定量运用数学公式［ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct内参基因）实验组-（Ct目的基因-Ct内参基因）对照］来计算相对量，Ct是热循环仪检测到达设定的阈值荧光信号时所经历的循环数。

假设每个循环增加1倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到的Ct值反映起始模板的量，一个循环的不同相当于起始模板数2倍的差异（2-ΔΔCt）。所以，2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。该方法不必制作标准曲线，但前提是目的基因与内参基因要有类似的扩增效率。

常见问题 1

问题表现：影响特异性的因素

常见问题 2

问题表现：影响重复性的因素

常见问题 3

问题表现：标准曲线的线性关系不佳

解决方案 1:减小加样误差。

解决方案 2：妥善保存标准品，防止降解。

常见问题 4

问题表现：影响敏感度高低的因素

解决方案 1: 用TaqMan探针代替SYBR Green。

解决方案 3: 要尽可能地优化引物设计。使两条引物的GC含量大致一致，使用纯化的引物进行实验等都有助于防止引物二聚体形成。