原位杂交测定组织和细胞内miRNA丰度

荧光原位杂交原位杂交是以已知序列核酸作为特异性探针与细菌、细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测的一种方法。

原位杂交测定组织和细胞内miRNA丰度的基本原理是如果被检测的染色体或DNA显微切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，两者经变性退火复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。

将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子生物素（或地高辛），可利用该报告分与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在显微镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

器材：

摇床、显微镜。

试剂：

原位杂交法检测miRNA的基本过程可分为如下几步：

A. 取石蜡包埋组织，切取5 µm厚度切片包被在载玻片。

B. 将载玻片放在二甲苯中去石蜡，50 r/min振荡10 min后，换一次二甲苯再以同样转速振荡10 min，接着依次用100% 、95% 、80% 、75% 的乙醇清洗各5 min，最后用去离子水冼2次。

C. 将载玻片浸没在0.2 mol/L HCI溶液中5 min，在25 °C用PBS（含蛋白酶K 40 µg/ml）消化20 min，再转移至PBS（含0.2% 甘氨酸）中漂洗，在含4% 多聚甲醛的PBS（pH7.4）中固定10 min。

D. 将载玻片用PBS漂洗2次之后，用乙酸酐／三乙醇胺（6.25 µl乙酸酐，5.2 µl 12mol/L HCI，14 µl三乙醇胺，H₂O补至1 ml）浸泡10 min，PBS漂洗4次，每次5 min。

E. 49.5 ℃在杂交缓冲液中预杂交2 h。

F. 在预热的100 ml杂交缓冲液中加入2 µl（终浓度5 pmol/L）探针，将载玻片放于其中，49.5 ℃过夜。

G. 切片用5xSSC洗涤2次，再接着用50% 甲醛/2xSSC在50 ℃洗涤3次，每次20 min。

H. 用TBST漂洗5次，然后将组织切片放于封闭液中，4 ℃封闭16 h。

I. 载玻片用TBST洗4次，每次10 min，杂交液洗2次，每次10 min。接着在暗室中加上商品化染色溶液（1 ml染色溶液，2.4 µl 100 mg/ml四氯唑蓝，3.5 µl 50 mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸，1 nm10l/L左旋咪唑），孵育4~48 h，对组织也需要进行同样的探针染色。

J. 当达到期望的亮度时，将载玻片转移至终止液，终止反应。