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简介
miRNA是长度为20-23个核苷酸的单链小分子RNA,在真核生物由RNA聚合酶II催化、以基因组DNA为模板转录产生,但不翻译为蛋白质。miRNA在进化上保守,并广泛存在于动物、植物、真菌及病毒基因组中。
目前,用于组织和细胞内miRNA丰度的检测实验的方法主要有5种:
Northern印迹测定组织和细胞内miRNA丰度、实时定量PCR测定组织和细胞内miRNA丰度、微阵列芯片测定组织和细胞内miRNA丰度、转录组深度测序测定组织和细胞内miRNA丰度、原位杂交测定组织和细胞内miRNA丰度。
原理
应用
来源:丁香实验团队
操作方法
Northem印迹杂交是1977年,StarkGR建立的,与Southern印迹杂交相对应称为Northern印迹(Northern blotting)杂交。
实时定量PCR测定组织和细胞内miRNA丰度由于成熟miRNA的长度仅为约22nt,无法进行PCR扩增反应.所以在进行该法检测之前,要对所提取的miRNA进行结构上的处理。一般的做法是在成熟miRNA的一端连接上一段已知序列的核苷酸,经反转录后,再以此为模板进行后续的PCR扩增。目前常用的是茎环法和加尾法。
微阵列芯片测定组织和细胞内miRNA丰度循环芯片测序又称第二代测序技术、转录组深度测序,即对布满DNA样品的芯片重复进行基于DNA聚合酶或连接酶以及引物对模板进行的一系列延伸反应和荧光序列读取反应,通过显微设备观察并记录连续测序循环中的光学信号。该类测序方法采用了大规模矩阵结构的微阵列分析技术,阵列上的DNA样本可以被同时并行分析。
原位杂交测定组织和细胞内miRNA丰度荧光原位杂交原位杂交是以已知序列核酸作为特异性探针与细菌、细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测的一种方法。
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