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做qpcr的时候要有什么操作注意事项

相关实验:组织和细胞内miRNA丰度的检测实验

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dxy_n4jex0k8

设备罗氏480,实验设计确保扩增效率接近1,ct值在都在20-30之间,现在已经是三个孔混在一起再分装了,而且移液器移液都在量程一半以上,比如30ul就不用100的枪而是打两次15ul。但是算出来每个空重复值还是大于0.2,差很多,能差个位数。是算法问题吗?还是操作问题呢?

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3 个回答

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vae1476

有帮助

你的溶解曲线好吗?有可能实验引物本身不对,注意下CT值大小,溶解曲线的情况,

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府宅

有帮助

1.加入模板时应先进行适度稀释,再加入反应体系中,提高扩增效率。但模板浓度过低导致重复性越差,应减少样品的稀释倍数。

2. 引物设计时,扩增片段不宜太长,一般在80-300bp均可;退火温度要高,一般要在 60℃以上。并且要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

3. 体系中引物浓度过高或者引物二聚体均会引起溶解曲线不止出现一个主峰。

4. 设置阴性对照,防止水和mix被污染。

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dxy_gwrp7ndq

有帮助

1. 用于qPCR反应的RNA应避免DNA的污染,RNA提取和反转过程中应小心谨慎。

2. 操作过程中避光,冰上操作。

3. cDNA模板避免反复冻融,否则会引起模板的降解。

4. 模板量不足或降解将导致CT值出现过晚或者不出现。对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起。

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