做qpcr的时候要有什么操作注意事项

你的溶解曲线好吗？有可能实验引物本身不对，注意下CT值大小，溶解曲线的情况，

1.加入模板时应先进行适度稀释，再加入反应体系中，提高扩增效率。但模板浓度过低导致重复性越差，应减少样品的稀释倍数。

2. 引物设计时，扩增片段不宜太长，一般在80-300bp均可；退火温度要高，一般要在 60℃以上。并且要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

3. 体系中引物浓度过高或者引物二聚体均会引起溶解曲线不止出现一个主峰。

4. 设置阴性对照，防止水和mix被污染。

1. 用于qPCR反应的RNA应避免DNA的污染，RNA提取和反转过程中应小心谨慎。

2. 操作过程中避光，冰上操作。

3. cDNA模板避免反复冻融，否则会引起模板的降解。

4. 模板量不足或降解将导致CT值出现过晚或者不出现。对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起。