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学会这 8 个qPCR 操作,每天都有阳性 data !

丁香实验

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装备很重要:做出心中的梦中情图,最基本的一步就是拥有一把好用的移液枪,保证其量程是准确的,且每次做 RT-qPCR 的时候要固定使用那一把移液枪,避免造成因枪的不同带来的误差。

保证 RNA 质量:A260/A280要在 2 左右;不同组的样品 cDNA 的浓度也要一致,只有这样你所要扩增的模板的基线才是一致的,后续出来的 CT 值才有参考意义。

反复确认引物种属:很多刚接触实验的小白们,拿着 human 的引物在鼠样本上做 RT-qPCR,,也许跑到天荒地老这个结果也无法得到,既浪费了时间精力,又浪费了你的感情。并且为了保证引物的特异性,在使用一个新的引物之前,要跑一个琼脂糖凝胶电泳,观察一下条带是否是单一的,是否有引物二聚体。

手法要细致:RT-qPCR 灵敏度高,对加样的精度和准度要求都比较高,因此在拥有一把精准的枪的基础上,我们要保证每次加样前,移液枪与枪头要连接紧密。移液枪与枪头如果连接松散,会影响精准度,吸上来的液体可能并不是我们想要的。每加一个样换一个枪头。

反应体系需讲究:在我们配置RT-qPCR反应体系时,一定要先加量大的试剂,然后再加入量较小的试剂,防止因所需试剂过少,人为操作带来的误差。并且在配置完成后,震荡离心,混合均匀,然后再分装在每一个小管中,再加入cDNA。

注意!配置 MIX 时要避免强光直射,全程操作在冰上进行。配置 MIX 一般来说我们多配1-2个样品的体系,这样保证最后每个孔都能有同等体积的液体。

cDNA充分混匀:加入cDNA前,要将cDNA充分混匀,可用移液枪吹打后再加样,减少误差。

枪头操作小窍门:加样的时候枪头不要完全挨着管壁,让打出的液体能够碰到管壁上即可,边加样边慢慢将移液枪撤出。加完液后要看看枪头里是否有残留没打掉的液体。

注意!多人实践后证明,RT-qPCR一档吸二挡打的方法不精准,建议各位二挡吸一档加样(按到底吸液体,出液时不要按到底),这样加样非常准确,并且副孔的CT值也误差很小!试试这个方法你也会从这样让你心碎的溶解曲线转而拥有这样的梦中情图。

复孔!RT-qPCR 每个样品最好做 3 个副孔,这样为了防止我们因人为操作不当,导致某个副孔值不准确,我们可以去除不准确的孔,将剩下两个孔用于实验数据分析。

RT-qPCR 这个实验需要大家用心去对待,各种细小的偏差可能都会导致结果失之千里。

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