设 计 和 克 隆 一 个 sh R N A 到 慢 病 毒 沉 默 载 体 中 ：版 本 A

 

材料

试剂
Advantage GC-2 聚合酶混合液（BD)

2XBES 缓 冲 血 清（B B S ) 溶 液（50 mmol/LBES， 280 mmol/LNaCl， I. 5 mmol/L Na2 HPO4

混合 16. 3 g NaCl、 10. 65 g BES (Calbiochem 3 9 1 3 3 4 ) 和 0. 2Ig Na2 HPO4。添加双 蒸 水 至900 ml。溶 解 ，用 lm ol/L N aO H 调 节 p H 至 6. 9 5 , 添 加 双 蒸 水 至 终 体 积 I U 过 滤 除 菌 ，16m l分 装 后 保 存 于 4°C 。

CaCl2 (2. 5 m o l/L )储备液

细胞： 293T 人类胚胎肾细胞（Invitrogen)

二 甲 亚 砜（dimethylsulfoxide) (DMSO; 7%)

DMEM 培养基

ELISA 试剂盒， p24 (New England Nuclear Life Science product NEK050B) (可选 ：见步骤 15)

胎 牛 血 清（FBS)

Hank 平衡盐溶液（HBSS; Invitrogen)

克隆到 pGEM -T 中的 H l 启 动 子（Promega)

质粒

pMDL (Gag-Pol)

pREV

pVSV-G

对 于 质 粒 制 备 ，使用 I ug/fxl 的 QIAGEN plasmid maxipreps。

多聚赖氨酸（Poly-L-lysine) (Sigma-Aldrich P 4832)

溶 于 PBS，终 浓 度 0. 0 0 1 % 。过滤除菌保存于一 20°C 。

限制性内切核酸酶： NheI、 Ssph、XbaI

蔗 糖（20% 溶 于 HBSS)

设备

Beckman 管（358126 和 326819)

过 滤 器（0. 22um 或 0. 45um)

培养箱，预 设 37°C (3% 和 10%CO2)

离心管

PCR 仪

Sw58 和 Sw55 离 心 机（Beckman)

细胞培养皿（15 cm， 6 孔板）

方法

shR N A 的设计和克隆

1 . 在基因中选择一段靶标序列来沉默，如对于 GFP: GCAAGCTGACCCTGAAGTTC