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设 计 和 克 隆 一 个 sh R N A 到 慢 病 毒 沉 默 载 体 中 :版 本 A

相关实验:研发表达 SiRNA 的慢病毒载体实验

最新修订时间:

材料与仪器

步骤

 

材料

试剂
Advantage GC-2 聚合酶混合液(BD)

2XBES 缓 冲 血 清(B B S ) 溶 液(50 mmol/LBES, 280 mmol/LNaCl, I. 5 mmol/L Na2 HPO4

混合 16. 3 g NaCl、 10. 65 g BES (Calbiochem 3 9 1 3 3 4 ) 和 0. 2Ig Na2 HPO4。添加双 蒸 水 至900 ml。溶 解 ,用 lm ol/L N aO H 调 节 p H 至 6. 9 5 , 添 加 双 蒸 水 至 终 体 积 I U 过 滤 除 菌 ,16m l分 装 后 保 存 于 4°C 。

CaCl2 (2. 5 m o l/L )储备液

细胞: 293T 人类胚胎肾细胞(Invitrogen)

二 甲 亚 砜(dimethylsulfoxide) (DMSO; 7%)

DMEM 培养基

ELISA 试剂盒, p24 (New England Nuclear Life Science product NEK050B) (可选 :见步骤 15)

胎 牛 血 清(FBS)

Hank 平衡盐溶液(HBSS; Invitrogen)

克隆到 pGEM -T 中的 H l 启 动 子(Promega)

质粒

pMDL (Gag-Pol)

pREV

pVSV-G

对 于 质 粒 制 备 ,使用 I ug/fxl 的 QIAGEN plasmid maxipreps。

多聚赖氨酸(Poly-L-lysine) (Sigma-Aldrich P 4832)

溶 于 PBS,终 浓 度 0. 0 0 1 % 。过滤除菌保存于一 20°C 。

限制性内切核酸酶: NheI、 Ssph、XbaI

蔗 糖(20% 溶 于 HBSS)

设备

Beckman 管(358126 和 326819)

过 滤 器(0. 22um 或 0. 45um)

培养箱,预 设 37°C (3% 和 10%CO2)

离心管

PCR 仪

Sw58 和 Sw55 离 心 机(Beckman)

细胞培养皿(15 cm, 6 孔板)

方法

shR N A 的设计和克隆

1 . 在基因中选择一段靶标序列来沉默,如对于 GFP: GCAAGCTGACCCTGAAGTTC

(Tiscornia et al. 2003) 0 循环次数 变性 复性 延伸 第一轮 3min,94〇C 30轮 30s,94〇C 30s,55〇C 40s,72〇C 最后一轮 IOmin,72°C 4. PCR的结果就是扩增出大约4OObp的片段,可以连接到A/T 载体中进行测序或者直 接克隆到慢病毒质粒中。 消化插入片段,琼脂糖凝胶电泳纯化。 M ieI 消化慢 病毒质粒,电泳纯化,然后去磷酸化。 一 般 5〇n g 载 体 连 接 IOOng插 人 片 段 ,转 化 感 受 态 细 菌 。可 以 通 过 S^ I 酶 切 筛 选 连 接 转 化 成 功 的 菌 落 ,原 载 体 只 含 有 一 个 S5/>I 位 点 ,而 插 人 目 的 片 段 的 载 体 会 获 得 另 外 一 个 S ^ I 位 点 ( 位 于 H l 启 动 子 ) 。使 用 H l-F 引 物 5'-T G G C A G G A A G A T G G C T G T G A l并 测 序 来 确认发 夹 结 构 也 是 非 常 重 要 的 。因为发夹序列中的突 变 会 显 著 降 低 基 因 沉 默 的 效 率 。 5. 通过转染或转导( 慢病毒颗粒)到表达靶标基因的细胞来鉴定克隆的shRNA沉默 盒。另外还可以在易于转染的细胞系( 如 293T ) 中加入与shRNA沉默盒共表达的 靶基因cDNA。 当 靶 标 m R N A 只 在 特 定 细 胞 中 存 在 或 没 有 靶 标 的 特 异 性 抗 体 时 ,这 种 方 法 特 别 有 用 。 一 般 ,我 们 在 每 个 孔 中 (6 孔 板 )加 人 200n g 靶 标 cD N A 和 500〜 IOOOng包 含 沉 默 盒 的 质 粒 进 行 转 染 。转 染 后 48〜72h 收 集 细 胞 进 行 免 疫 印 迹 分 析 。 慢病毒载体制备 6. 准 备 12cmX15cm平皿慢病毒:转染前24h,准备平皿和细胞。 a. IOml聚赖氨酸附着12cmX15cm平皿,室温培养15min,吸除液体,以增加细 胞黏着力。 b. 立即从两个细胞汇合的15cm平皿中接种细胞到12cmX 15cm平 皿 ( DMEM+ 1 0 % FBS)。加 入 1 % 抗生素-抗菌素溶液不影响转染。细胞传代次数不宜过多, 超 过 20次的就不要用了,否则生长很慢。某些品牌的FBS不支持有效转染,会 引起病毒滴度过低。 • 2
C. 细胞过夜培养。 7. 在转染时,细胞应该达到7 0 % 〜8 0 % 的汇合度并均匀分布确保其滴度。使 用 CaPO4 方法将质粒混合液转化入细胞: a. 分别将四种质粒加入到50m l管中。对于一个12cmX15cm平皿,加人: 27〇jug慢病毒载体 176^g pMDL (Gag-Pol) 95jug pVSV-G 68/^tg pREV b. 准备 CaCl2工 作 液 (13.5ml 0.25mol/L CaCl2) 加入质粒混合液。加 入 13.5ml 2父: 638液 。颠倒混勻,室温孵育151^11。 匕加入转染混合液( 滴状分布)(2.251111/平皿) 。轻轻晃动平皿37°0:, 3 % ( :〇 2孵 育过夜。 8. 转 染 16〜U h 后 ,移除培养基。每个培养皿中加入15m l新 鲜的 DMEM+ 2 % FBS, 37°C 、 3 % CO2过夜培养。 9. 培养皿中收集上清, 0.22〜0.45^xm过滤器过滤。每个培养皿中加入15m l新鲜培养 基 ,培养过夜。 .过滤的上清可以在4°C下储存数日。 10. 收集培养基如上步一样过滤。 11. 将 步 骤 9、 1 0 得到的上清合在一起。转 移 入 Beckman管 (358126),每 管 25〜 29ml。 SW2 8 rotor 中 20°C , 19 400r/min 离心 2h,浓缩病毒颗粒。 12. 所有沉淀用Iml HBSS重悬。再 用 Iml HBSS清洗所有的管。 13. 合并的HBSS中继续加入HBSS至 3ml,在 Beckman管 ,(326819)中 加 人 I.5ml 2 0 % 庶糖溶液分层。 SW55 rotor 中 20 C , 21 000r/min 离心 I.5h。 14. 沉淀在IOOjul HBSS中重悬,再 用 10(^1 HBSS清洗管子,合并。低速振荡器中振 荡重悬的病毒预备液15〜30min。离 心 IOs 除去碎片。病毒液分装一8〇 °C储存。可 以储存数月。避免反复冻融。 15. 利用p24 ELISA试剂盒量化衣壳蛋白P24来进行病毒预备液定量,或者通过加入到 慢病毒载体中的标记来进行生物学定量。 滴度正常范围为IO9〜101°个/ml, 但是如果组装质粒的转染效率不理想的话,滴度可能 降低

来源:丁香实验

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