学会这个方法，5 分钟找到合适的 qPCR 引物

师姐说：师妹啊，你帮我找几个基因的 qPCR 引物吧。你问怎么找？师姐说查文献啊！于是你一头雾水的开始查文献：打开 Pubmed，输入基因名，ATG7,enter，哇，有几万条记录，点下 best match，再选下近 5 年的文献，筛选一下，哇，还有几万篇相关文章。

好吧，那就选第一篇看吧，点进去，找全文，往下拖，找到材料和方法，找啊找，终于找到了，那就 copy。还挺幸运的，可是，一看时间，半个小时过去了，这才查了一个基因的，还有好几个，一个晚上又没了，心里默念：师姐真坑！

终于在今天结束前将所有引物都发给了师姐，明天就可以跟师姐一起愉快的跑 qPCR 了。

过了两天，师姐一脸不高兴的说：师妹你在哪找的引物啊？跑出来的都是什么鬼？

你一看溶解曲线是双峰，心里也很委屈，嘀咕到：你不是说在文献里面找吗？我就是在文献里面找的。

师姐问：多少分的文献？你默默的打开 pubmed，找到昨天找的文献，一查 IF 3 分不到，你默默的不敢说话了！

设计 qPCR 引物，一种方法就够了，省时省力，关键还靠谱，再也不会让师姐失望了！

1. 首先还是打开 pubmed，选择 gene, 输入基因名 ATG7，点 search。

2. 选择正确的基因名和物种，记住基因名下面的那串数字，也就是 gene ID，也可以直接 copy 这串数字。

3. 打开 primer bank。网址是：

https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/，

在 search by 的地方选择 NCBIGene ID，Species 那里选择相应的物种，将上一步 copy 的数字放在 For text 里面，然后点 Submit。

4. 出来了，在 Gene Description 那里再对一下基因信息，确定是自己想找的基因后，在几对引物中选择自己看着顺眼的那对拿去合成就好了。

开玩笑啦，还是有选择标准的：首先看看 Amplicon Size，也就是扩增长度，建议在 100~300bp 间比较好扩增；引物长度在 20~25bp 较好，而且上下游引物间不要相差超过 5bp；再就是看看 Tm 值，60℃左右，相差不要超过 1℃。

综上，将选择好的引物（这里我选择 Primer Pair 3），进一步验证，这里很友好，支持复制粘贴。

5. 还是回到 Pubmed，打开里面的 primerblast。网址是：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome） 。

将选中的引物直接 copy 到相应的位置。

在 Database 里选 Refseq mRNA，在 Get Primer 后的第一个小方框上也打个勾，再点 Get Primer，这样结果就会显示在新的标签页。

接着再在 Database 里选 Genomes for selected organisms（primary referenceassembly only），点击 Get Primer。

得到结果：在 Refseq mRNA 的数据库里面我们得到的就是这对引物能扩增出什么产物来，一看结果都是 ATG7，只是有不同的转录本，扩增产物长度也一样，没关系，反正扩出来都是 ATG7。

在 Genomes for selected organisms（primary referenceassembly only）里查找的目的是看看是否用该对引物会扩增出非特异性的产物，没有是最好的，说明引物很特异；如果有，也不要着急，看看到底扩增出来什么？

诶，好像不是我想要的基因，是不是不好啊？不要着急，看看 Product length：1657bp，放心吧，这么长的产物，qPCR 是扩增不出来的（一般 500bp 就比较难扩增出来了）。

所以结合以上判定方法，你选的引物基本上就能跑出漂亮的溶解曲线了，为什么不说百分之一百，因为这还取决于你提取的 RNA 合格不！

上面介绍的这种查找 qPCR 的引物的方法在我这里是屡试不爽，介绍给实验室的同学和师弟师妹们用也是深受好评，primer bank 里面同一个基因引物基本不会超过 3 对，只要你不是选择困难症患者，整个操作过程 5 分钟就能搞定。

但是友情提醒下，blast 真的很慢，所以等你对 primer bank 有了十足的信心之后，你基本不会再借用 blast 来判断你选的引物好不好，结合扩增产物长度、引物长度和 Tm 值就能愉快的三选一或二选一了，这又为你节约了 2 分钟，是不是很开心！