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PCR 实验 protocol 汇总

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问多重PCR可以分开做吗？十六对引物就做十六孔，都是同一次逆转的cDNA，然后一起扩增

balalaLy

如果是要样品或者组别之间进行比较最好一起做或者至少每次做都有可以相互比较的组别。

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问第二次pcr跑出来的条带和第一次pcr跑出来的位置不一样，这是什么原因？

灵枢天问

可能是第一次的RNA有降解，逆转录出来的模板本身就有问题，所以p出来条带也有问题，太小了，你可以发个图片过来看看

4 回答878 围观

问细菌做定量pcr，以cDNA做模板，pcr条带很杂，而用基因组做模板条带单一，这是什么原因？谢谢回答！

bamboopiggy

cdna是不同长度的，如果你的引物不是那么特异，产物就会很多。而genomic dna做模板，引物是跨内含子设计，比较长，非特异产物在30秒内扩增不出来

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问做荧光定量PCR和半定量PCR有什么区别？半定量的PCR退火温度和荧光定量PCR是一样的吗？

迟C迟

荧光定量PCR和半定量RT-PCR都可以用来检测基因的表达量的，但二者检测的东西多少有些不同。荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入可以和双链DNA特异性结合的荧光染料（SYBR green）或者和目的DNA片段结合的荧光探针（taqman)，通过监控PCR过程中的荧光的变化，并且和某些管家基因的荧光变化进行对比反应出目标基因的表达量。荧光定量PCR的主要有效数据是荧光信号增长到最大值的一半时的时

3 回答4894 围观

问PCR扩增到特异性产物后，回收PCR产物，PCR产物用BamHI和EcoRI（NEB公司的酶）在随EcoRI的BUFFER中双酶

bamboopiggy

蓝斑说明没有连接成功，NEB公司的酶，不需要酶切那么长的时间，并且酶切后，你跑胶鉴定了么？如果有条带，再进行胶回收和连接。一般QIAGEN quick spin column的柱子出问题的可能性不大，最大的可能就是你酶切完，没有跑胶鉴定。

3 回答688 围观

问mRNA 的 realtime PCR 怎么操作？引物怎么加？

王建勇

就是逆转录的时候要用特异性RT引物，其他的合普通的realtimePCR一样的。

1 回答823 围观

问做qpcr的时候要有什么操作注意事项

dxy_gwrp7ndq

1. 用于qPCR反应的RNA应避免DNA的污染，RNA提取和反转过程中应小心谨慎。2. 操作过程中避光，冰上操作。3. cDNA模板避免反复冻融，否则会引起模板的降解。4. 模板量不足或降解将导致CT值出现过晚或者不出现。对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起。

3 回答679 围观

问如何看QRT-PCR 结果中的Cq值？

丁香实验

新版的软件都叫Cq值，不叫Ct值了，不必理会。Ct值15－25是最好，10－30之间也接受。如果超过30了，得看一下复孔是否一致，如果一致，也接受。如果不一致，基本就是废的。

2 回答1833 围观

问血浆提取RNA用于跑QPCR跑不出的原因？

丁香实验

血浆 -是将新鲜血液加抗凝剂后离心析出的上清液.（血细胞沉降下去了），血液提取RNA 应该是在白细胞中提，首先血液中的RNA本身就少，血浆中的RNA很有可能是白细胞破裂析出的部分，自然更少，前提是不是要搞清楚rna是从血液中的哪里提出

1 回答1689 围观

问实时荧光定量试验，是否需要均一化处理？

剑藏鞘

内参的选择也很重要

2 回答652 围观

问求PCR结果怎么做出这样的散点图

seuzsl

先求每个样本的2的-Δct，然后所有结果除以对照的均值，就可以作图了

1 回答1610 围观

问qPCR各样本间内参差值控制在多少才合适呢？

seuzsl

理论上讲不同样本内参Ct值的差异并不影响结果解释，因为对于同一个样本而言，目的基因ct-内参ct应该是一个常数，而在提取RNA时，取样量（即，细胞数）存在差异会导致得到的RNA总量有差异，即便通过细胞计数取了等量的细胞，提取时RNA的得率也不同，即便取了相同质量的RNA进行逆转录，不同样本间降解程度、其它rna表达水平都可能会导致内参ct存在差异（当然这种差异不应该很大），这就是为啥一定要做内参，

2 回答14356 围观

问如何进行QPCR中多组数据的统计分析？

香柏树001

相对表达量，我用的是2-△△CT法，每组3各平行要有的，然后得出的Ct值，计算出2-△△CT值就可以了，这样就得出3各2-△△CT，要比较的两组之间求P值就行了。附件讲的比较详细。

1 回答579 围观

问为什么目的基因Ct值正常，反而内参的Ct值很高

杜小涛

引物反复冻融次数多了就有可能降解，不过你这个可以先考虑基因时空表达的问题，如果确定你做的这个时期和组织确定表达量并不低，就有可能是引物反复冻融导致的降解了

3 回答596 围观

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