qPCR各样本间内参差值控制在多少才合适呢？

热爱医学的小猪

2021-11-02

荧光定量PCR内参差多少是可以接受的？荧光定量PCR是常用的针对mRNA水平的研究方法，可以同时检测多种目的基因的mRNA水平，为文章增加说服力。我们做的实验方法大致如下：取小鼠淋巴结细胞制成单细胞悬液，分选CD4 T细胞（通过磁珠分选得到，各样本所得细胞总数基本一致，大约在10E6左右），利用经典的Trizol方法提取RNA，其质量在各样本间基本一致且符合要求，选取2ug RNA，用40ul反转录体系（Takara反转录试剂盒），37度10分钟，85度5秒，12度结束反转录。得到的cDNA加一倍的稀释液用于荧光定量PCR检测，荧光定量的体系采用SYBR作为荧光物质。然而荧光定量PCR历来以敏感著称，在实验中经常会遇到一些问题。我们遇到的问题是内参表达（内参的Ct值）在各样本间表达不均一，请看下图（这是不同样本内参的相对表达量，可以看出内参的表达相差在10倍左右

2 个回答

seuzsl

2021-11-02

有帮助

理论上讲不同样本内参Ct值的差异并不影响结果解释，因为对于同一个样本而言，目的基因ct-内参ct应该是一个常数，而在提取RNA时，取样量（即，细胞数）存在差异会导致得到的RNA总量有差异，即便通过细胞计数取了等量的细胞，提取时RNA的得率也不同，即便取了相同质量的RNA进行逆转录，不同样本间降解程度、其它rna表达水平都可能会导致内参ct存在差异（当然这种差异不应该很大），这就是为啥一定要做内参，并且每次扩增样本时都要做的原因。通过你的结果，有两种可能，一是内参不合适，考虑换内参；二是你的结果就是真实的结果

毛线鸡公山

2021-11-02

有帮助

内参基因/管家基因有varibility的，有些时候我的内参差值也会超过3，但是大多数我可以控制在2以内，原则上要在0.5之内，不过很难。。 HPRT我没有用过，据说不太好。。我用的是GAPDH和BETA-ACTIN。。至于WB嘛，其实也很难说，因为我用BCA法measure the concentration of protein，loading to 30ug protein，然后有一个样本的内参照条带很淡，比其他的所有样本都要淡，那个样本浓度我测过3次，没有出错（3次我都做了标曲）。嘿嘿，也是找不到原因，诡异的事很多滴~也不见得WB要比PCR好吧~~ 暂时只能说那么多了，貌似不能解决你的问题呀~~