PCR实验引物设计有什么要求？TM值一般多少最合适？

1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；

2、引物GC含量一般为40%-60%， 45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近，一般Tm值不超过 5℃。

3、引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间，最好为 72℃左右。

4、引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰，且 3’端的碱基一般不用A；引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，或者引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败，

5、碱基要随机分布，且引物自身和引物之间 不能有连续4个碱基的互补。

6、尽量在基因的编码区 （CDS序列）上设计引物，限制基因组DNA扩增。

长度至少要16bp，通常为18-30bp。不要内部存在互补序列。

引物最好在模板cDNA的保守区内设计。引物长度一般在15-30碱基之间。引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72℃。引物3′端要避开密码子的第3位。引物3′端不能选择A，最好选择T。碱基要随机分布。 引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。扩增产物的单链不能形成二级结构。引物应具有特异性。引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 引物长度一般在15-30碱基之间。引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72℃。引物3′端要避开密码子的第3位。引物3′端不能选择A，最好选择T。碱基要随机分布。引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。扩增产物的单链不能形成二级结构。引物应具有特异性。

引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右。Tm值在72℃左右可使复性条件最佳，至少要在55-80℃之间。

原则：

1、引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

2、 产物不能形成二级结构。

3、引物长度一般在15~30碱基之间。

4、G+C含量在40%~60%之间。

5、碱基要随机分布。

6、引物自身不能有连续4个碱基的互补。

7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。

8、引物5′端可以修饰。

9、引物3′端不可修饰。

10、引物3′端要避开密码子的第3位。

引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右。Tm值在72℃左右可使复性条件最佳，至少要在55-80℃之间。