PCR扩增到特异性产物后，回收PCR产物，PCR产物用BamHI和EcoRI（NEB公司的酶）在随EcoRI的BUFFER中双酶

蓝斑说明没有连接成功，NEB公司的酶，不需要酶切那么长的时间，并且酶切后，你跑胶鉴定了么？如果有条带，再进行胶回收和连接。一般QIAGEN quick spin column的柱子出问题的可能性不大，最大的可能就是你酶切完，没有跑胶鉴定。

大部分是蓝斑说明可能是载体酶切不完全，也可能是没有在载体酶切后跑胶回收载体，这样不能完全除去酶切掉的小片断(Qiagen的柱子对小片断的回收比较好)，后来连接反应中小片断可能又连上了。

1、柱子回收一般不存在问题，需要检查是否操作存在问题；

2/设计引物时有没有保护酶切位点两边碱基；

3、酶是不是失效了；

4、蓝斑说明酶切不完全，也有可能是酶切后跑胶回收载体；

5、建议酶切后用碱性磷酸酶去磷酸化，防止载体自身环化。