【求助】XbaI和EcoRI双酶切构建时出现空载
丁香园论坛
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最近在构建一个质粒。
根据我的目的基因序列，筛了两个酶切位点，而且只有这两个酶切位点能用，XbaI和EcoRI,
设计引物时XbaI 加了两个保护碱基，EcoRI 加了三个保护碱基。根据takara公司的说明，选择了共用Buffer1xM,酶切，连接，转化之后挑克隆，抽质粒酶切鉴定，发现都是空载体。网上说XbaI对甲基化敏感，有什么对策？因为我别无他选，只能用这两个酶。
不胜感激！！！
根据我的目的基因序列，筛了两个酶切位点，而且只有这两个酶切位点能用，XbaI和EcoRI,
设计引物时XbaI 加了两个保护碱基，EcoRI 加了三个保护碱基。根据takara公司的说明，选择了共用Buffer1xM,酶切，连接，转化之后挑克隆，抽质粒酶切鉴定，发现都是空载体。网上说XbaI对甲基化敏感，有什么对策？因为我别无他选，只能用这两个酶。
不胜感激！！！
双切之后跑电泳了吗，有时候是没切开。
查了一下，这两个酶好像没有同工酶。如果不能用别的位点，一般要用特殊的菌株，JM110， SCS110这类甲基化缺失的菌株。
查了一下，这两个酶好像没有同工酶。如果不能用别的位点，一般要用特殊的菌株，JM110， SCS110这类甲基化缺失的菌株。
gisang wrote:
双切之后跑电泳了吗，有时候是没切开。
查了一下，这两个酶好像没有同工酶。如果不能用别的位点，一般要用特殊的菌株，JM110， SCS110这类甲基化缺失的菌株。
我先是逐个单切，验证都能在同一种buffer里切的开，然后才双酶切的，连了两次，克隆都是空载体。这次想总结下，不过还不是很清楚原因，总觉得是载体没有被双切。还有Pcr之后回收的目的片段也没法确定是不是被双酶切了。
抱歉，很久没来了。一般双酶切的位点过于靠近的效果就会很差，你可以单切，纯化再切，在连接。
另外调整载体和片段比例，如果可能最好设计引物做菌落PCR鉴定连接效果。
HST04没用过，但是缺少那两个酶的都应该可以，既然能切开，还是先改变酶切方法吧。
另外调整载体和片段比例，如果可能最好设计引物做菌落PCR鉴定连接效果。
HST04没用过，但是缺少那两个酶的都应该可以，既然能切开，还是先改变酶切方法吧。
一般来说，空载体连接的情况大多是因为，目的片段酶切不彻底，不能与载体相连，建议你将浓度较高的PCR片段也分步酶切，每次单酶切都要超过11个小时。个人经验，欢迎拍砖
wj1989113您好！
关于您的问题，可以给您以下建议：
1.如果是空载体的话，那么有可能是酶切没有完全切开，您可以做个对照实验，直接把酶切的载体转化，不要加插入片段，检查是否是载体酶切没有切开；
2.根据您的描述，您的这2个酶切位点相距过近，同时酶切的话可能会存在位于前面的酶切开后，后面的酶因为缺少保护碱基而酶切效率低下的情况；这种情况建议先切后面的位点，待线性化后（可跑胶确认）再加入第一种酶酶切，这样可以保证酶切效率；
3.
为了避免自连，可以对酶切后的载体使用热敏磷酸酶（M0289）对载体去磷酸化，补加10x的热敏磷酸酶Buffer后该反应可以在
NEBuffer1，2，3，4和EcoRI Buffer中进行。反应完成后通过加热可以是蛋白失活，从而不需纯化便可以进行连接反应。
4.XbaI是典型的dam甲基化敏感内切酶，您可以分析您的载体序列，看是否是甲基化敏感，如果是甲基化敏感，那么您的载体肯定切不开，可以有两种解决方案：A.用甲基化缺陷型菌株转化提取质粒之后再做酶切,NEB有免费赠送的甲基化缺陷型菌株；B.可以用phi29DNA聚合酶进行链置换反应，再进行酶切就可以切开了。
wj1989113 wrote:
我先是逐个单切，验证都能在同一种buffer里切的开，然后才双酶切的，连了两次，克隆都是空载体。这次想总结下，不过还不是很清楚原因，总觉得是载体没有被双切。还有Pcr之后回收的目的片段也没法确定是不是被双酶切了。
看到楼主说逐个单切验证了，但是就个人经验，很多时候单切时效果不错的双切效果却很差。建议在双切后进行验证，看是否切开。另外如果发现双切很难切开的话，建议分步酶切，往往效果会好一点，过程也更可控，但是注意每一次酶切后都进行验证。此外，采用大体系进行双酶切可能效果也会更好一点，我一般在构建的时候选择50或者100ul体系。
换个菌株，另外PCR产物可以先插到T载体上就可以确定它确实被切开了
NEB wrote:
wj1989113您好！
关于您的问题，可以给您以下建议：
1.如果是空载体的话，那么有可能是酶切没有完全切开，您可以做个对照实验，直接把酶切的载体转化，不要加插入片段，检查是否是载体酶切没有切开；
2.根据您的描述，您的这2个酶切位点相距过近，同时酶切的话可能会存在位于前面的酶切开后，后面的酶因为缺少保护碱基而酶切效率低下的情况；这种情况建议先切后面的位点，待线性化后（可跑胶确认）再加入第一种酶酶切，这样可以保证酶切效率；
3.
为了避免自连，可以对酶切后的载体使用热敏磷酸酶（M0289）对载体去磷酸化，补加10x的热敏磷酸酶Buffer后该反应可以在
NEBuffer1，2，3，4和EcoRI Buffer中进行。反应完成后通过加热可以是蛋白失活，从而不需纯化便可以进行连接反应。
4.XbaI是典型的dam甲基化敏感内切酶，您可以分析您的载体序列，看是否是甲基化敏感，如果是甲基化敏感，那么您的载体肯定切不开，可以有两种解决方案：A.用甲基化缺陷型菌株转化提取质粒之后再做酶切,NEB有免费赠送的甲基化缺陷型菌株；B.可以用phi29DNA聚合酶进行链置换反应，再进行酶切就可以切开了。
1. XbaI 是dam甲基化敏感内切酶，如何分析载体序列，看是否是甲基化敏感 ？
2. 载体上两个酶切位点太紧会影响酶切效率，多近算近？ 或者说两个酶切位点相距多远才安全？
3. 载体去磷酸化后，PCR片段一般需要T4 PNK来磷酸化。 在这个过程中，如果在PCR引物的5’段合成时就加上磷酸化修饰，是否可以省去T4 PNK这一步？
谢谢！
NEB wrote:
wj1989113您好！
关于您的问题，可以给您以下建议：
1.如果是空载体的话，那么有可能是酶切没有完全切开，您可以做个对照实验，直接把酶切的载体转化，不要加插入片段，检查是否是载体酶切没有切开；
2.根据您的描述，您的这2个酶切位点相距过近，同时酶切的话可能会存在位于前面的酶切开后，后面的酶因为缺少保护碱基而酶切效率低下的情况；这种情况建议先切后面的位点，待线性化后（可跑胶确认）再加入第一种酶酶切，这样可以保证酶切效率；
3.
为了避免自连，可以对酶切后的载体使用热敏磷酸酶（M0289）对载体去磷酸化，补加10x的热敏磷酸酶Buffer后该反应可以在
NEBuffer1，2，3，4和EcoRI Buffer中进行。反应完成后通过加热可以是蛋白失活，从而不需纯化便可以进行连接反应。
4.XbaI是典型的dam甲基化敏感内切酶，您可以分析您的载体序列，看是否是甲基化敏感，如果是甲基化敏感，那么您的载体肯定切不开，可以有两种解决方案：A.用甲基化缺陷型菌株转化提取质粒之后再做酶切,NEB有免费赠送的甲基化缺陷型菌株；B.可以用phi29DNA聚合酶进行链置换反应，再进行酶切就可以切开了。
http://www.dxy.cn/bbs/topic/20255841?onlyHost=1&ticket=ST-124129-uRi7CaMFrOfgf3swkO2U2feLopffo25Nnig-20
楚布衣 wrote:
NEB是高手，不知是不是NEB公司的人。请教几个问题：
1. XbaI 是dam甲基化敏感内切酶，如何分析载体序列，看是否是甲基化敏感 ？
2. 载体上两个酶切位点太紧会影响酶切效率，多近算近？ 或者说两个酶切位点相距多远才安全？
3. 载体去磷酸化后，PCR片段一般需要T4 PNK来磷酸化。 在这个过程中，如果在PCR引物的5’段合成时就加上磷酸化修饰，是否可以省去T4 PNK这一步？
谢谢！
楚布衣 您好！
以下是对您这几个问题的答复，请您参考。
1.dam甲基化敏感的识别序列是GATC，dcm甲基化敏感识别序列是CCWGG（W=A or T)，如果您的酶切位点形成了上述的敏感位点，那么就是甲基化敏感序列，切割受影响。举例说明，XbaI的识别序列是5'-TCTAGA-3',如果您的载体序列XbaI酶切位点两侧的是GA或TC，即形成5‘-GATCTAGA-3'或者5’-TCTAGATC-3',那么就是甲基化敏感，酶切切不开，任何一端形成GATC的敏感都会受影响，是重叠性阻断；
2.载体上两个酶切位点的距离远一些比较好，首先是因为内切酶切割时受到其它的序列影响，其原理和加保护碱基的原理是一致的，如果周围序列少，会影响其酶切的效率，之间至少需要12个碱基，而且经验看来，12个碱基确实是比较少的，会影响切割效率；其次，酶切位点之间距离较远，就可以通过跑胶判断出是否完全酶切，便于我们分清楚切割下来的片段和没有酶切的片段；
3.其实我们把载体去磷酸化是为了防止自连，是否需要对引物进行5’磷酸化要根据您的实验设计。如果您的PCR产物是需要酶切的，那么酶切之后它本身就是磷酸化的，其实可以不用T4PNK磷酸化，本身酶切切下来的就是有5‘磷酸化的，连接过程中，只要有一端有磷酸化，就可以进行连接；如果您是引物不经过酶切直接连接的话，那么您可以在引物上进行5‘端磷酸化，不需要进行T4PNK磷酸化就可以连接。
NEB wrote:
楚布衣 您好！
以下是对您这几个问题的答复，请您参考。
多谢NEB的回复
1.dam甲基化敏感的识别序列是GATC，dcm甲基化敏感识别序列是CCWGG（W=A or T)，如果您的酶切位点形成了上述的敏感位点，那么就是甲基化敏感序列，切割受影响。举例说明，XbaI的识别序列是5'-TCTAGA-3',如果您的载体序列XbaI酶切位点两侧的是GA或TC，即形成5‘-GATCTAGA-3'或者5’-TCTAGATC-3',那么就是甲基化敏感，酶切切不开，任何一端形成GATC的敏感都会受影响，是重叠性阻断；
这个问题我清楚了，谢谢！听说NEB免费提供dam-的细菌， 不知具体该如何操作才能获得？
2.载体上两个酶切位点的距离远一些比较好，首先是因为内切酶切割时受到其它的序列影响，其原理和加保护碱基的原理是一致的，如果周围序列少，会影响其酶切的效率，之间至少需要12个碱基，而且经验看来，12个碱基确实是比较少的，会影响切割效率；其次，酶切位点之间距离较远，就可以通过跑胶判断出是否完全酶切，便于我们分清楚切割下来的片段和没有酶切的片段；
这个你的回答似乎不符合我们实际操作。 实际克隆中，大家通常在MCS区选取两个酶切位点时，很少会考虑要两者间隔要超过12bp。在做PCR加酶切位点，加保护碱基时，我看也很少给引物加上酶切位点后，再有加12个nt的保护碱基的，这样可能会导致引物有6+12 个碱基的非特异。 在实际操作中，无论是载体酶切，还是PCR产物酶切，没有12个碱基的保护序列，酶切效果还是可以的。不知道你说的要至少相隔12个碱基有无文献证据或者你们内部的实验数据。
3.其实我们把载体去磷酸化是为了防止自连，是否需要对引物进行5’磷酸化要根据您的实验设计。如果您的PCR产物是需要酶切的，那么酶切之后它本身就是磷酸化的，其实可以不用T4PNK磷酸化，本身酶切切下来的就是有5‘磷酸化的，连接过程中，只要有一端有磷酸化，就可以进行连接；如果您是引物不经过酶切直接连接的话，那么您可以在引物上进行5‘端磷酸化，不需要进行T4PNK磷酸化就可以连接。
从你的回答中，我确认了“在PCR引物的5’段合成时就加上磷酸化修饰，是可以省去T4 PNK”的。 我考虑的是1. PCR的多次高温循环，是否会对引物5‘的磷酸化修饰产生影响/破坏？ 2. 如果我是PCR产物A 与 PCR产物B 连接后，其产物C作为一个大的新的引物来做新的PCR， 这个过程中，PCR产物A，B的引物PaF，PaR 以及PbF,PbR分别需要如何磷酸化修饰？ 谢谢！
楚布衣 您好！
以下是对您问题的解答，仅供您参考。
1.听说NEB免费提供dam-的细菌， 不知具体该如何操作才能获得？
NEB规定欲申请dam-的菌株，需要下订单，然后依据您的订单帮您申请免费菌株。
2.这个你的回答似乎不符合我们实际操作。 实际克隆中，大家通常在MCS区选取两个酶切位点时，很少会考虑要两者间隔要超过12bp。在做PCR加酶切位点，加保护碱基时，我看也很少给引物加上酶 切位点后，再有加12个nt的保护碱基的，这样可能会导致引物有6+12 个碱基的非特异。 在实际操作中，无论是载体酶切，还是PCR产物酶切，没有12个碱基的保护序列，酶切效果还是可以的。不知道你说的要至少相隔12个碱基有无文献证据或者 你们内部的实验数据。
非常抱歉，可能是我表述的不清楚，是这样的，我们建议在酶切位点上加6个以上保护碱基，在我们的网站上公布的常用的限制性内切酶，标注出具体加几个保护 碱基，该内切酶的切割效率可达到100%的，其余的没有公布的内切酶都是建议加6个以上保护碱基，据此，我们建议多克隆位点的选择中，两个酶切位点距离远一些，利于完全切开。实际操作中，的确有些研究人员是不加那么多保护碱基的，且选择多克隆酶切位点时，也有其它的限制，所以常常没有考虑这么多。不过经常有客户反馈，两个酶切位点靠近，载体特别容易自连，这也比较符合情况，所以还是建议在条件允许的情况下，选择距离比较远的两个酶切位点。
3.从你的回答中，我确认了“在PCR引物的5’段合成时就加上磷酸化修饰，是可以省去T4 PNK”的。 我考虑的是1. PCR的多次高温循环，是否会对引物5‘的磷酸化修饰产生影响/破坏？2. 如果我是PCR产物A 与PCR产物B 连接后，其产物C作为一个大的新的引物来做新的PCR， 这个过程中，PCR产物A，B的引物PaF，PaR 以及PbF,PbR分别需要如何磷酸化修饰？ 谢谢！
PCR引物5端磷酸化是常用的方法之一，从这个角度考虑，应该不会受到很明显的影响，我也没有查找更多的资料，您如果了解更多的资料的话，可以给大家分享一下。其实，引物加磷酸化修饰，价钱比较贵，您也可以选择用T4PNK处理效果也很不错，而且引物只是针对单独的引物磷酸化，而T4PNK是可以对所有需要磷酸化的产物进行磷酸化的，这个需要根据您的实验设计，您可以自己选择，仅供参考。
您这里说的是一个重叠PCR，在我的理解中，我认为其他的可以不用修饰，只需要修饰PaF,PbR即可，因为最后还是要把这一段连接到其他载体上，中间这两个引物只需要有重叠部分即可，通过一次PCR过程即可把这两段连接在一起，他们不需要磷酸化的连接，理论上讲，就可以不用磷酸化修饰。
如果您有新的见解，可以提出来一起讨论。
以下是对您问题的解答，仅供您参考。
1.听说NEB免费提供dam-的细菌， 不知具体该如何操作才能获得？
NEB规定欲申请dam-的菌株，需要下订单，然后依据您的订单帮您申请免费菌株。
2.这个你的回答似乎不符合我们实际操作。 实际克隆中，大家通常在MCS区选取两个酶切位点时，很少会考虑要两者间隔要超过12bp。在做PCR加酶切位点，加保护碱基时，我看也很少给引物加上酶 切位点后，再有加12个nt的保护碱基的，这样可能会导致引物有6+12 个碱基的非特异。 在实际操作中，无论是载体酶切，还是PCR产物酶切，没有12个碱基的保护序列，酶切效果还是可以的。不知道你说的要至少相隔12个碱基有无文献证据或者 你们内部的实验数据。
非常抱歉，可能是我表述的不清楚，是这样的，我们建议在酶切位点上加6个以上保护碱基，在我们的网站上公布的常用的限制性内切酶，标注出具体加几个保护 碱基，该内切酶的切割效率可达到100%的，其余的没有公布的内切酶都是建议加6个以上保护碱基，据此，我们建议多克隆位点的选择中，两个酶切位点距离远一些，利于完全切开。实际操作中，的确有些研究人员是不加那么多保护碱基的，且选择多克隆酶切位点时，也有其它的限制，所以常常没有考虑这么多。不过经常有客户反馈，两个酶切位点靠近，载体特别容易自连，这也比较符合情况，所以还是建议在条件允许的情况下，选择距离比较远的两个酶切位点。
3.从你的回答中，我确认了“在PCR引物的5’段合成时就加上磷酸化修饰，是可以省去T4 PNK”的。 我考虑的是1. PCR的多次高温循环，是否会对引物5‘的磷酸化修饰产生影响/破坏？2. 如果我是PCR产物A 与PCR产物B 连接后，其产物C作为一个大的新的引物来做新的PCR， 这个过程中，PCR产物A，B的引物PaF，PaR 以及PbF,PbR分别需要如何磷酸化修饰？ 谢谢！
PCR引物5端磷酸化是常用的方法之一，从这个角度考虑，应该不会受到很明显的影响，我也没有查找更多的资料，您如果了解更多的资料的话，可以给大家分享一下。其实，引物加磷酸化修饰，价钱比较贵，您也可以选择用T4PNK处理效果也很不错，而且引物只是针对单独的引物磷酸化，而T4PNK是可以对所有需要磷酸化的产物进行磷酸化的，这个需要根据您的实验设计，您可以自己选择，仅供参考。
您这里说的是一个重叠PCR，在我的理解中，我认为其他的可以不用修饰，只需要修饰PaF,PbR即可，因为最后还是要把这一段连接到其他载体上，中间这两个引物只需要有重叠部分即可，通过一次PCR过程即可把这两段连接在一起，他们不需要磷酸化的连接，理论上讲，就可以不用磷酸化修饰。
如果您有新的见解，可以提出来一起讨论。
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