荧光定量 PCR

定量 PCR 是指以一种标准作对照，通过对 PCR 终产物的分析或 PCR 过程的监测，对 PCR 起始模板量进行定量的技术。

根据原理的不同，目前主要采用的定量 PCR 方法包括极限稀释法、设立内参照物的定量 PCR、荧光定量 PCR （fluorescence quantity PCR，FQ-PCR）等。

其中荧光定量 PCR 是最新发展起来的一项定量 PCR 技术。

荧光定量 PCR 基本原理是在 PCR 反应体系中加人荧光基团，在 PCR 反应过程中连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化，当信号增强到某一阈值，此时的循环次数即循环阈值 Ct（cycle threshold，Ct）被记录下来。

该循环参数 Ct 和 PCR 体系中起始模板数的对数之间有严格的线性关系，利用不同梯度的阳性定量标准模板扩增的 Ct 值和该阳性定量标准的模板数经过对数拟和作图，制成标准曲线。

最后根据待测样品的 Ct 值，通过标准曲线就可以准确地确定起始模板的数量。根据所用的探针的不同，可以分为两种，一种是 Taq-man 荧光探针，另外一种是荧光染料。

SYBR 是不对称菁类荧光素，它非特异嵌合于 DNA 双螺旋结构中的小沟内，发出荧光信号，而不掺入链中的Sybr染料分子不会发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

此方法避免了设计、标记荧光探针和使用价格昂贵、复杂的试剂，适用于任何 PCR 扩增体系。

器材：

①荧光定量 PCR 仪

②紫外分光光度计

③微量移液器（20 μl）

④0.2 ml Ep管（灭菌）

试剂：

①材料： 标准 DNA 模板、样品 DNA

②SYBR I 荧光染料

③上游引物及下游引物

④dNTP 混合液

⑤Taq DNA 聚合酶

⑥10 x PCR 反应缓冲液

荧光定量 PCR 的基本过程可分为如下几步：

（一）试剂配制

（1）上游引物及下游引物 浓度 20 μmol／L。

（2）dNTP 混合液 将 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP 钠盐各 100 mg 合并，加去离子水 2 ml 溶解，用 0.1 mol／L NaOH 调节 pH 值至 7.0～7.5，使其浓度为 5 mmol／L，分装后 -20 ℃ 保存。

现也有商品化的混合液（各 2 mmol／L）供应。

（3）Taq DNA 聚合酶 5 U／μl，使用时其在 50 μl 反应体积终浓度为 1～2.5 U。

（4）PCR 反应缓冲液（10x）500 mmol／L KCI，100 mmol／L Tris-HC1（pH 8.4），15 mmol/L MgCl₂。

（二）定量标准品的制备

（1）在一个 Ep 管中加入标准 DNA 模板 1 μg、特异上游引物及下游引物各 2 μl、10 x PCR 反应缓冲液 5 μl、Taq DNA 聚合酶 5 U，灭菌水补足 50 μl，混匀。

（2）在 PCR 仪上进行扩增反应：95 ℃ 变性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，30 个循环。

（3）将 PCR 产物纯化、测序验证，测定 OD 值，根据分子质量，换算出每毫升拷贝数，贮存备用。

（三）制作定量标准曲线

（1）将定量标准品分别稀释 10²、10⁴、10⁶、10⁸、10¹⁰ 倍，分别取稀释标准品 5 μl，按上面的方法加入 PCR 反应试剂，另外再加入 Sybr I 荧光染料 2 μl，总体积 50 μl。

（2）分别按上述 PCR 反应条件在荧光定量 PCR 仪上进行 PCR 反应，由计算机自动生成定量标准曲线。

（四）样品测定

（1）在 Ep 管中加入样品 DNA 5 μl，上游引物及下游引物各 2 μl，10 x PCR 反应缓冲液 5 μl，Taq DNA 聚合酶 5 μl ，SYBR I荧光染料 2 μl，灭菌水补足 50 μl，混匀。

按上述 PCR 反应条件在荧光定量 PCR 仪上进行扩增反应。

（1）严格优化 PCR 扩增反应的实验试剂与条件

①模板的制备注意避免 DNA 的降解，并尽量纯化 DNA 使其不含任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA 聚合酶抑制剂以及能与 DNA 结合的蛋白质。

②为保证 PCR 特异性扩增，引物的设计应符合以下原则：引物长度以 15～30 个碱基为宜，上下游引物的长度差别不能大于 3个。

（G＋C）含量应在 40％～60％，4 种碱基要在引物中分配均匀；引物自身不应存在互补序列，不能有大于 3 bp 的反向重复序列，否则引物自身会折叠形成发夹结构。

上下游引物之间不应有多于 4 个的互补或同源碱基，尤应避免 3’端的互补重叠，以防形成引物二聚体。

引物的 3’端不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能，3’端碱基尽量不选用T。

引物的 5’端可以进行修饰，加上一些有用而又不与靶 DNA 互补的序列计算出来的 2 个引物的解链温度相差不能大于 5 ℃。

③引物浓度应先通过预实验确定最适浓度，浓度范围一般为 0.2～1.0 μmol／L。

④循环参数 PCR 中控制温度是关系到实验成败的重要环节。退火的温度及时间依赖于引物的长度、浓度以及碱基组成中（G＋C）含量，一般来说，退火温度为引物的解链温度减去 5 ℃。

延伸温度要根据 Taq DNA 聚合酶的最适作用温度而定，通常在70～75 ℃，延伸时间则依据扩增片段的长度而定。

⑤PCR 缓冲液 Mg^2＋的浓度对 PCR 产物的特异性及产量有明显影响，各种单核苷酸浓度为 200 μmol／L，Mg^2＋ 为 1.5 mmol／L 时较合适。

另外，不同厂家的 Taq DNA 聚合酶的缓冲液成分也不相同，使用时应注意是否配套。

⑥为避免非特异性扩增，可以采用 Taq DNA 聚合酶的「热启动法」。

（2）设置对照实验：为确保结果的可肯定性，应设置阳性对照及阴性对照或空白对照。

（3）防止 PCR 污染。