荧光定量 PCR 异常扩增曲线分析攻略

近几年，从科学研究到临床检测，从「非洲猪瘟」检测到「新冠病毒」检测，荧光定量 PCR 仪器已成为分子生物学研究的常规设备。检测方法的迅速发展，检测任务的紧急也对检测人员提出了更高的要求，需要他们具备熟练判断数据结果的能力。对于荧光定量 PCR 的结果的判断，最直观的判断就是看扩增曲线是否正常。很多老师在平时实验中会遇到异常扩增曲线的困扰，比如打折的扩增曲线、复孔间重复性不好、阴性样本扩增曲线抬升等。面对异常的扩增曲线，大家也不用担心，接下来我们会结合几个实例，带着大家一起来看一下比较常见的异常扩增曲线的分析攻略。

1、确认软件设置是否正确

对照试剂盒说明书，检查时间、温度、循环数、荧光采集等是否设置正确。有一个比较容易忽略的设置问题是，需要看下所选用的试剂中是否含有 ROX 来作为参比荧光染料。Applied Biosystems™ 系列荧光定量 PCR 仪器可以用 ROX 来作为参比荧光染料，用以校正仪器系统以外的物理误差，比如均一化校正由于移液误差或者蒸发导致的批内体积误差等。目前市面上有的的荧光定量 PCR 预混液是不含有 ROX 的，当用此类试剂的时候，应该将 ROX 参比功能关闭，否则可能会出现图一左图所示的，扩增曲线异常的现象。遇到这种问题，可以在 Plate Setup 设置中找到 Passive Reference，把 ROX 改为 None，重新分析一下，结果就变正常了（图一右图）。Applied Biosystems™ 系列荧光定量 PCR 仪器默认是对所有荧光通道及所有样品孔进行荧光采集，用户不用担心数据丢失，实验完成后，还可以对设置错误的反应孔的荧光通道、样品名称等进行更改。

图一：使用不含 ROX 试剂，忘记更改 Passive Reference 结果图及更改后的结果图

还有一些结果，多组分图扩增曲线没有抬升，是很明显的阴性样本，但是扩增图谱的扩增曲线抬升了，这样就会与阈值线相交，反而有了 CT 值。这是由于软件在进行基线自动扣除的时候出现错误，引起了扩增曲线抬升（图二）。出现这种情况可以采取手动调整基线的方法，重新定义基线即可正常，即将基线起点改为荧光信号稳定的循环数（一般是 3），基线终点要改成扩增曲线起峰的前一个循环数（比如起峰是在第 25 个循环，那基线的终点就是 24）。引起这样的原因是由于选用的耗材、试剂或者操作的原因导致背景荧光信号有所波动，从而造成反应孔的自动基线扣除错误。

图二：基线自动扣除错误，导致扩增曲线抬升

2、确定耗材及仪器配件是否使用正确

耗材对于荧光定量 PCR 来说比较重要，很多异常的扩增曲线是由于耗材使用不当引起的。常见的耗材相关问题包括：

1）错误使用成普通 PCR 仪器所对应的耗材

普通 PCR 耗材一般透光度比较差，会造成荧光扩增曲线异常，比如打折的扩增曲线（图三）；

图三：错误使用普通 PCR 耗材的结果

2）未选择跟仪器加热模块规格匹配的耗材

目前 Applied Biosystems™ 系列荧光定量 PCR 仪加热模块分 0.2 ml 跟 0.1 ml 两种，实验前一定要确定自己的仪器是哪一种加热模块，再来选择对应的耗材。如果 0.1 ml 加热模块用成 0.2 ml 耗材，则会造成耗材压扁，甚至造成机器故障；如果 0.2 ml 加热模块用成 0.1 ml 耗材，则会造成反应管的外壁和荧光定量 PCR 仪器的温控模块没有充分接触，从而出现热传导不充分，进而影响酶的活性，会引起重复性不好（图四），或者溶解曲线多峰（非特异扩增），甚至是假阴性结果；

图四：耗材规格跟加热模块不匹配造成重复孔间差异

3）使用了质量比较差的耗材

Applied Biosystems™ 系列的荧光定量 PCR 仪器是一个开放的平台，客户可以使用开放的试剂、开放的耗材。但是目前市面上荧光定量 PCR 耗材种类繁多，质量也是良莠不齐，在耗材选择上尽量选择质量、品牌好一点的，切莫因为便宜选用质量很差或不符合要求的耗材，否则会引起一系列问题，引来实验的困扰，造成不必要的时间、精力和试剂、样本的浪费。比如质量不好的耗材可能会引起荧光值不稳定，这会造成反应孔的自动基线扣除错误，得到不准确的 CT 值（图五左图），更换质量好的耗材后，荧光信号正常（图五右图）；

图五：质量不好的耗材引起荧光值不稳定图及更换 Applied Biosystems™ 耗材后结果

如果使用的 PCR 反应板封膜质量不好，在 PCR 过程中受到水蒸气的影响，容易产生变形（图六），这样会引起「optical warping」，即「光学扭曲」现象（图七 左图），该实验中由于使用了 ROX 作为参比染料，ROX 有效的校正了这种荧光信号的变化，均一化的扩增图结果是正常的（图七 右图）。

图六：PCR 过程中水蒸气使得封膜变形

图七：光学扭曲结果图及 ROX 均一化结果图

除了耗材外，跟仪器配套使用的配件也要检查是否使用正确，比如 QuantStudio 5 配套的 8 联管托架，在使用的时候只用托架的下半部分，如果忘记把上半部分取下，有可能会影响扩增（图八），具体 Applied Biosystems™ 系列的荧光定量 PCR 仪器配件对应使用情况，可参考之前的文章《贴士：正确使用荧光定量仪器配件和耗材（更新版）》。

图八：未将托架上半部分取下，造成有些靶标未扩增

3、确定所用试剂是否正常

如果设置都正确，耗材及配件也都没问题，但是扩增曲线还是异常，这时候要确定下所用试剂是否正常。首先要确定试剂是否有效，包括查看试剂是否在有效期内，是否反复冻融多次，运输条件是否正常。可以通过比较试剂的批次号，结合实验中的阳性对照结果，确定试剂的有效性。其次要观察扩增完的试剂体积，如果在扩增过程中有试剂的蒸发，可能会引起扩增曲线抬升现象，如果实验体系中加入了 ROX 作为参比荧光，ROX 荧光可以区分扩增曲线抬升是真扩增，还是蒸发。比如反应体系存在蒸发，水分丢失，ROX 浓度会增加，ROX 参比荧光上抬（图九左图），而正常孔中 ROX 荧光会一直不变（图九右图），所以在加完试剂上机前，一定要检查耗材是否已经密封，防止试剂蒸发，试剂蒸发严重的还可能导致整个实验室的气溶胶污染。

图九：试剂蒸发引起扩增曲线抬升

4、确定实验过程中的操作细节

如果以上都正常，还要确定下实验过程中的操作细节。比如在做标准曲线的时候是否是梯度稀释的标准品，如果不是梯度稀释标准品，可能会引起标准曲线扩增效率或者 R2 值异常；从冰箱冷冻中取出的试剂是否有混匀，如果试剂融化后没有混匀，这时候取出的试剂不是均一的，会影响后面的扩增；定量 PCR 预混液跟核酸模板加好后是否混匀，如果没有混匀，特别是样本体积比较大的时候（超过 PCR 体系的 20%），更容易发生 optical mixing 现象。因为样本是水相会在上层，试剂（含有甘油成分）会在下层，在前期的 PCR 过程中不足以混匀完全，这样会形成折射，荧光较强，而一般加热几个循环后样本跟预混液会混匀，荧光就变稳定了（图十）。

图十：样本跟预混液未混匀现象

还有上机的反应体系里尽量不要有大的气泡，有气泡的话，中间容易形成折射，干扰荧光的采集（图十一）。所以实时荧光定量 PCR 实验的细节还是要特别注意的。

图十一：反应体系中有气泡

以上是我们在面对常见的一些异常扩增曲线的分析思路，希望能够帮助各位老师处理扩增曲线异常的问题。除了我们提到的几种情况之外，在平时实验过程中我们可能还会遇到「千姿百态」的异常扩增曲线，大家可以利用上面介绍的思路加以分析，有些我们可能需要具体问题具体分析，也欢迎大家跟赛默飞的技术支持团队进行沟通和交流。