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实时荧光定量 PCR 的原理及应用

丁香实验团队

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聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction,PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后,我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析,也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。

无论定性还是定量分析,分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下,我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。

实时荧光定量 PCR 技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 简称 Real Time PCR)是在定性 PCR 技术基础上发展起来的核酸定量技术。

实时荧光定量 PCR 技术于 1996 年由美国 Applied biosystems 公司推出,在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程,使每一个循环变得「可见」,最后通过 Ct 值和标准曲线对样品中的 DNA(or cDNA) 的起始浓度进行定量的方法。

实时荧光定量 PCR 是目前确定样品中 DNA(或 cDNA) 拷贝数最敏感、最准确的方法。如果用于 RNA 检测,这被称为逆转录实时 PCR 即(Real-time RT-PCR)是实时 PCR 法,它是指对 DNA 或经过反转录(RT-PCR)的 RNA 通过聚合酶链式反应并实时监测 DNA 的放大过程,在扩增的指数增长期就测量扩增产物,因为扩增指数增长期测量值与特异 DNA(RNA)起始量存在相关性,从而实现定量检测。

RealTime PCR 的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸,从而可通过监测 CT 值而实现对原始目标基因的含量定量。实时荧光定量 PCR 法最大的优点是克服了终点 PCR 法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差,实现 DNA/RNA 的精确定量。

该技术不仅实现了对 DNA/RNA 模板的定量,而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点,该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。

microRNA 实时荧光定量 PCR 的技术特点
虽然 microRNA 实时定量 PCR 是一种最近才发展起来的检测技术,其技术细节还在不断完善中,但是 microRNA 实时定量 PCR 检测系统,相对其它 microRNA 检测技术有以下优点:

● 高特异性,可以只对成熟 microRNA 进行定量,有效区分成熟 microRNA 分子和前体分子以及其它成熟 microRNA 的同源分子;

● 快速,简单,省时,整个操作只需两步,不到 3 个小时,即可获得高质量的数据;

● 检测灵敏度高,样品消耗少,仅需 1-10ng 的总 RNA 或 50pg 左右的 microRNA;

● 超宽的线性范围,可跨越 7 个数量级。

实时定量 PCR 的系统构成及工作原理

荧光定量检测系统由实时荧光定量 PCR 仪,实时荧光定量试剂,通用电脑,自动分析软件等构成。设备由荧光定量系统和计算机组成,用来监测循环过程的荧光。
与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平,这就是分析荧光数据的水平。样品到达域值水平所经历的循环数称为 Ct 值(限制点的循环数)。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大,这样可以获得最准确,可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品,线性回归分析将产生一条标准曲线,可以用来计算未知样品的浓度。
所谓 Real-time Q-PCR 技术,是指在 PCR 反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在 real-time 技术的发展过程中,两个重要的发现起着关键的作用:
在 90 年代早期,TaqDNA 多聚酶的 5′核酸外切酶活性的发现,它能降解特异性荧光标记探针,因此使得间接的检测 PCR 产物成为可能。
此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致 real-time Q-PCR 方法在研究工作中的运用。
定量 PCR 仪的梯度功能:对于使用染料法的定量 PCR 反应,虽然有各种各样的 PCR 引物设计软件或者经验公式计算熔解温度(Tm 值),但运用的公式不同、引物序列不同,Tm 值的差异会很大。引物的熔解温度决定了退火温度。而且模版中碱基的组合千变万化,对于特殊片断,经验公式得到的数据不一定能得出准确的结果,退火温度细微的差异对结果都可能产生决定性的影响,因而「摸条件」一度是让人很头疼的问题。梯度 PCR 的出现部分解决了一些问题——在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在指定范围内按照梯度变化,根据结果,一步就可以摸索出最适合的反应条件。
不单退火温度,连变性温度和延伸温度都可以优化——对于多种聚合酶混合酶扩增多数高保真 Taq 酶来说这个非常重要,因为 Taq 和校正酶的最佳反应温度可能有显著差异,优化延伸温度就显得很重要。使用有梯度功能的荧光定量 PCR 可以一次完成以往多次实验才能完成的优化过程,简化了摸索 PCR 反应条件的繁琐实验,既节省实验时间提高效率,又节省实验成本。
PCR 反应过程中产生的 DNA 拷贝数是呈指数方式增加的,随着反应循环数的增加,最终 PCR 反应不再以指数方式生成模板,从而进入平台期。在传统的 PCR 中,常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测 PCR 反应的最终扩增产物,因此用此终点法对 PCR 产物定量存在不可靠之处。在 real-time Q-PCR 中,对整个 PCR 反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在 PCR 反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,因此可以在 PCR 反应处于指数期的某一点上来检测 PCR 产物的量,并且由此来推断模板最初的含量。
为了便于对所检测样本进行比较,在 real-time Q-PCR 反应的指数期,首先需设定一定荧光信号的域值,一般这个域值(threshold)是以 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline),荧光域值的缺省设置是 3~15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号,它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。Ct 值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明,每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct 值越小。 利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线,因此只要获得未知样品的 Ct 值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
1. Ct 值的定义
在荧光定量 PCR 技术中,有一个很重要的概念--Ct 值。C 代表 Cycle,t 代表 threshold,Ct 值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
2. 荧光域值(threshold)的设定
PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍,即:threshold = 10′SDcycle6-153. Ct 值与起始模板的关系。
研究表明,每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕,起始拷贝数越多,Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代 Ct 值。因此,只要获得未知样品的 Ct 值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
4. 荧光化学
荧光定量 PCR 所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下:
1)TaqMan 荧光探针:PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR 扩增时,Taq 酶的 5-3 外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条 DNA 链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。而新型 TaqMan-MGB 探针使该技术既可进行基因定量分析,又可分析基因突变(SNP),有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2)SYBR 荧光染料:在 PCR 反应体系中,加入过量 SYBR 荧光染料,SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。

实时荧光定量 PCR 技术的应用领域

实时荧光定量 PCR 技术是 DNA 定量技术的一次飞跃。运用该项技术,我们可以对 DNA、RNA 样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度;后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外我们还可以对 PCR 产物或样品进行定性分析:例如利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体,以区分非特异扩增;利用特异性探针进行基因型分析及 SNP 检测等。目前实时荧光 PCR 技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面:
DNA 或 RNA 的绝对定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物拷贝数的检测,RNAi 基因失活率的检测等。
基因表达差异分析。例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 (如药物处理、物理处理、化学处理等),特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 或差显结果的确证。
基因分型。例如 SNP 检测,甲基化检测等。

实时荧光定量 PCR 技术在医疗方面的应用:

病原体检测:
目前,采用荧光定量 PCR 检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、肝炎病毒、结核杆菌、细小病毒 B19、EB 病毒和人巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。
遗传及优生优育诊断:
到目前为止,人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗,只能通过产前监测,减少病婴出生,以防止各类遗传性疾病的发生,如为减少 X 连锁遗传病患儿的出生,从孕妇的外周血中分离胎儿 DNA,用实时荧光定量 PCR 检测其 Y 性别决定区基因是一种无创伤性的方法,易为孕妇所接受。另外还可以通过实时荧光定量 PCR 对孕妇弓形虫,梅毒等检测,这对找出不明原因流产和习惯性流产的病因提供有力的帮助,大大提高优生优育。
指导治疗:
对病原体定量分析显示:病原体量与某些药物的疗效关系。如 HCV 高水平表达,干扰素治疗作用不敏感,而 HCV 低滴度,干扰素作用敏感;在拉米夫定治疗过程中,HBV-DNA 的血清含量曾有下降,随后若再度上升或超出以前水平,则提示病毒发生变异等。
肿瘤基因检测:
尽管肿瘤发病的机理尚未清楚,但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。p53 癌基因的表达增加和突变,在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量 PCR 不但能有效地检测到基因的突变,而且可以准确检测癌基因的表达量。随着与肿瘤相关的新基因的不断发现,荧光定量 PCR 技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。
免疫方面检测:
通过荧光定量 PCR 检测出 B27,HLA 等来帮助诊断免疫性疾病,如强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、器官移植排异反应等。

实时荧光定量 PCR 技术在药物研究方面的应用:

新药开发研究
人用药物及其他药物:
针对一些感染性疾病的药物,如各种病毒病、细菌病等,在新药的开发过程中,快速了解药物对疾病进程的影响可以为新药开发节约大量的人力、时间和资金,与以前所用的 Elisa 等方法相比,实时荧光定量 PCR 技术可以快速、准确、定量、灵敏地测定血液或组织中病原体的含量,因此有利用分析药物的作用效果,为比较不同的配方的疗效、用药量、用药时间等等提供快速、定量的评价。
超早期感染用药物及疗法的研究与开发:
实时荧光定量 PCR 方法测定血液中病毒核酸的含量,因此不必等到病人体内产生抗体,同时,由于其灵敏度与 Elisa 相比不可同日而语,在病毒感染的早期,即血液中病毒含量很低时就可以测定。因此就出现了一个新的领域,即在病毒或细菌含量很低时如何用药,用什么药以及用药量等进行研究,为将疾病消灭在超早期作出贡献。
药物疗效研究:
对于一些已经上市的新药或是应用了很长时间的老药,其用药的效果以及用药量及用药时间都可以进行进一步的研究,为更加合理化的应用这些药物为人类造福进行进一步的研究。以前所用的方法由于不能准确定量,灵敏度也不够,因此有很多需要研究的内容没有完成。这一方面需要研究内容很多,意义也很大。
新的愈后指标的研究:
对于感染性疾病,在药物作用至一定程度后,就认为可以停药了,但是应该在什么停药,现在大都没有一个明确的指标,现在所用的指标由于受到检测方法的灵敏度及准确性限制,这一指标未必合理,因此有必要对治愈的指标以及指标与复发率以及疾病转化为其他疾病之间的关系等进行进一步的研究,从而为药物或疗法彻底治愈疾病打下坚实的理论基础。
新诊断及检验试剂的开发:
现有的很多诊断及检验方法都不能同时满足快速、灵敏、定量的要求如现有培养法、Elisa 法等等,而荧光定量 PCR 方法以则可以做到这一点,从而可为临床疾病、商检、粮油检验、食品检验、血液检验等等开发新的试剂,从而提高检验的灵敏度、速度及准确性等;这类试剂的种类是非常多的,所开发的试剂的社会效益及经济效益都是很巨大的。
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