实时荧光定量 PCR-FP 技术

带荧光标记的寡核苷酸探针分子小，偏振光弱。当探针与 DNA 上的特异片段结合后分子量增大，偏振光增强。在 PCR 扩增时，随着引物介导的新链形成，探针从模板上解离下来，重新成为游离状态，偏振光又减弱。

在每一个 PCR 循环退火阶段，探针又可与 DNA 链重新配对，偏振光增强。在此阶段检测偏振光的增值，可对其进行定量检测。而当所扩增的核酸序列中不含与探针相配对的特定 DNA 片段时，荧光探针无法与核酸序列配对，其荧光偏振值很弱。故可检测扩增核苷酸序列中是否含有目的 DNA 片段。

通过荧光强度和标准品浓度制作工作曲线，检测目的基因、对目的基因进行定量。

MJ Research V2.0；Victor Ⅱ荧光偏振检测仪；dNTPs、Taq DNA 聚合酶、血清标本、引物和探针。

1、血清处理：在 30 μl 血清标本中加 30 μl 处理液（10 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0 1 mmol/L EDTA、1 ml/L NP40）于离心管中煮沸 15 min，7 000 r/min 离心 5 min。吸取上清液 2 μl 作模板。

2、PCR 扩增反应和液相杂交: 取 2 μl 模板加到 28 μl PCR 反应液中（10×PCR 缓冲液 3 μl，dNTPs 各 160 μmol/L，上游通用引物 C1 和下游通用引物 C2 各 3 pmol，探针 1.5 pmol，Taq DNA 聚合酶 1 U）。PCR 程序：94 ℃、2 min 后进入循环，94 ℃、5 s，60 ℃、55 s，72 ℃、45 s，循环 25 次，最后 94 ℃、5 s，45 ℃、20 s。

3、探针杂交：取 10 μl 杂交后的 PCR 产物加入含有 45 μl 杂交液（其中含 1 g/L 聚乙二醇 4 000，300 ml/L  DMSO，6×SSC（pH10），0.01 mol/L 磷酸钠（pH 8.0），1 mmol/L  EDTA（pH8.0），5 g/L  SDS，100 μg/ml 变性鲑鱼精 DNA，5 g/L 脱脂奶粉）的用于荧光偏振检测的微孔中，混匀后 40 ℃ 水浴放置 10 min，然后用 Victor Ⅱ 荧光偏振检测仪检测荧光素 R110 的偏振值。

4、判定标准计算: 本实验方案以检测 HBV DNA 血清样本为例，随机选 10 份 HBV DNA 阴性血清和 10 份 HBV DNA 阳性血清进行检测，cut off 值＝阴性样本结果的平均偏振光值＋10％×阳性样本结果的平均偏振光值。偏振光值＞cut off 值×110％ 的样本为阳性，＜cut off 值×90％ 的样本为阴性, 而在 2 个界限内（包括界限值）的样本为＋/－。判断标准为：cut off＝60 mp，那么阴阳性判断标准为 54 和 66 mp。

1、在 FP 检测中，被标记分子的大小是有限制的，对于特定的荧光团，增加分子量会降低潜在的检测窗口；

2、被标记分子的可允许大小也取决于标记的荧光寿命；

3、荧光标记分子大小<1.5 kD 最佳。