实时定量 PCR 实验

实时定量 PCR( qPCR ) 于 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司首先推出。传统 PCR 方法可对特定 DNA 片段进行指数级的扩增，并可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量分析。无论定性还是定量分析，都属于对 PCR 反应终产物的检测。但很多情况下我们更需要确定的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。由于该技术不仅实现了 PCR 从定性到定量的飞跃，而且与常规 PCR 相比，它具有特异性更强、结果准确可靠、自动化程度高等特点。

方法原理

方法应用

实时定量 PCR 技术主要运用在以下几个方面：

1. 实时定量 PCR 技术应用在肿瘤诊断和研究方面

2. 实时定量 PCR 技术应用在基因突变及其多态性方面

3. 实时定量 PCR 技术应用在病原体检测方面

(一) 引物和探针的设计

检查比对序列，先选择好探针的位置，然后设计引物使其尽可能地靠近探针。
探针的设计原则是：
1. 尽可能短，不要超过 30bp;
2.Tm 值应在 68 - 70℃ 之间；
3. 避免 5'-端是鸟苷酸 ( G ) , 以免发生悴灭作用；
4. 选择胞苷酸 (C) 多于鸟苷酸 (G) 的链作探针，G 的含量多于 C 会降低反应效率。

(二) PCR 反应及数据记录

提取细胞或组织中的总 RNA、反转录 PCR。PCR 反应需要在实时定量 PCR 仪专用反应板或管中进行，加入所有反应试剂后，将反应板置入仪器内，按照仪器操作说明完成反应和数据记录。

(三) 数据分析

一般而言，荧光扩增曲线可以分成 3 个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期，其形状是一条平滑的"S" 形曲线。

1. 标准曲线法的绝对定量用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线。标准品可以是纯化的质粒 DNA , 体外转录的 RNA, 或者是体外合成的单链 DNA。

2. 标准曲线法的相对定量属于自身相对标准曲线。所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样品靶序列的量来自于自身标准曲线，最终必须除以参照物的量。

3. Ct 比较法的相对定量 Ct 是热循环仪检测到达设定的阈值荧光信号时所经历的循环数。假设每个循环增加 1 倍的产物数量，在 PCR 反应的指数期得到的 Ct 值反映起始模板的量，一个循环的不同相当于起始模板数 2 倍的差异。该方法不必制作标准曲线，但前提是目的基因与内参基因要有类似的扩增效率。

实时定量 PCR 过程中的常见问题有：

（一）影响特异性的因素

1. 由于引物或探针降解、引物或探针设计不合理而造成的 Ct 值出现过晚或无 Ct 信号出现。优化方案是设计更好的引物或探针；优化引物浓度和退火温度。 避免引物或探针降解可在进行实时定量 PCR 实验前通过电泳检测其完整性。

2. 模板有基因组的污染而出现非特异扩增。优化方案是在 RNA 提取过程中避免 DNA 的污染，或通过引物设计避免非特异扩增。
   

（二）影响重复性的因素

（三）标准曲线的线性关系不佳

原因可能是
1.加样不准，使得标准品不呈梯度；

2.标准品出现降解；

3.模板浓度过高。理想的标准品应与样品具有高度同源性，虽然标准品和样品之间的差异始终存在，在制作标准曲线时，应至少选择 5 个稀释度的标准品，涵盖待测样品中目的基因量可能出现的全部浓度范围。

（四）影响敏感度高低的因素

1. 特异性产物与引物二聚体竞争荧光染料 SYBR Green, 从而降低了实时 PCR 的敏感性。可用 TaqMan 探针代替 SYBR Green。

2. 使用热启动方法加强特异性。在反应体系达到引物退火温度时才加入某一反应成分，因为引物二聚体是在各种试剂一经混合便开始形成的，所以用这种方法能有效地减少引物二聚体的形成。

3. 要尽可能地优化引物设计。使两条引物的 GC 含量大致一致，使用纯化的引物进行实验等都有助于防止引物二聚体形成。

4. Mg^{2 +}的浓度。Mg^{2 +}是影响 Taq 酶活性的关键因素。Mg^{2 +}浓度过低无法使 Taq 酶发挥最佳活性，浓度过高又会增加引物二聚体形成。一般来说，对以 DNA 或 cDNA 为模板的 PCR 反应，应选择 2 - 5 mmol/L 浓度的 MgCl₂; 对以 mRNA 为模板的 RT-PCR 而言，则应选择 4 - 8 mmol/L 浓度的 MgCl₂。