QPCR 法检测端粒长度

QPCR 法检测端粒长度的基本原理是尽管不同物种的端粒的重复序列可存在差异（表 11-2），但在同一种生物体内为特定序列，如人端粒是由 6 个碱基重复序列（TTAGGG）和结合蛋白组成。因此，对于端粒长度的检测，传统上可以对上述重复序列设计探针，采用核酸分子杂交技术进行测量。基于一个细胞中端粒长度的均值与端粒-单拷贝基因比率（Telomere-to-Single Copy Gene ratio，T/S 比率）有关的证据，通过测量和计算出 T/S 比率，从而测量出端粒的长度。

QPCR 法检测端粒长度的基本过程可分为如下几步：

A. 基因组 DNA 的抽提，方法同 Southern 印迹法检测，测定浓度后，稀释到约 20 ng/μl 浓度。

B. PCR 反应的设置，取模板 DNA 50～100 ng，分别加入以下端粒引物对（T 反应引物）以及对照单拷贝基因 36b4 引物对（S 反应引物）构成的 PCR 体系中，PCR 反应的条件为：PCR 活化反应 95 ℃ 10 min 以激活体系内的 Hot StarTaq DNA 聚合酶，然后进行两步循环法，T 反应的条件为 95 ℃ 变性 15 s，54 ℃ 退火／延伸混合 2 min，共 18 个循环。S 反应的条件为 95 ℃ 变性 15 s，58 ℃ 退火／延伸混合 1 min，共 30 个循环。

C. T/S 比率的计算，采用荧光定量 PCR 仪配套软件，分别确定 T 反应及 S 反应的 Ct 值-Ct（telomeres）及 Ct（36b4），根据 PCR 反应产物以 2 的指数倍递增原理，T/S 比率应该接近于公式［2C（telomeres）／2C:（36b4）］-1＝2-Δ。

1. S 反应也可以选择其他基因，但应是单拷贝基因。