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qPCR就是这么任性

诺唯赞

7097

去年我一直在跟qPCR、逆转录和SYBRGreen QPCR反应做斗争,其中遇到了不少困难,现在已经告别当初的迷茫。当时在我艰难摸索的时候就想,等我都学会了,我一定要写篇帖子,把当初遇到的一些困难和最后是如何解决这些问题的,写出来,一来可以帮助更多像我这样的人,二来也算让自己有点成就感了。

其中有一次,RNA提取好了,跑完胶3条带非常漂亮,测了浓度有500ng/ul呢,做完逆转录,满怀信心的做QPCR反应,做完发现Ct值偏大,在32以后,最大的能达到38,不能用,很纠结。

于是打电话给vazyme的技术,温柔的技术问了我好多问题,最后发现原因是我把预变性时间设定错了。俗话说,人类最大的错觉就是我以为。

我以为操作都是一样的,按照惯性思维就用以前的程序95℃30s进行预变性的,技术告诉我,不同公司的SYBR Green Mix由于酶的封闭方式不一样,预变性时间不一样,Vazyme的SYBR Green Mix采用的化学修饰的热启动酶,所以预变性时间是95℃5min,低于这个温度,少于这个时间,酶活无法完全释放出来。

弄清楚是这个原因以后,开始后悔自己不认真不仔细,如果早看说明书就不会浪费时间,浪费试剂,浪费样品了,悔!引物、cDNA、Mix混起来,重做,设定好程序,漫长的2个小时,等来的结果却发现扩增曲线挺好的,但是熔解曲线双峰。

Vazyme的技术问我,逆转录的时候有没有去基因组DNA?额,我确实没有去基因组,天呐,难道是这个原因?技术姐姐说,熔解温度这么高,不会是引物二聚体,一般引物二聚体的Tm较小,在75度左右。

有可能是基因组污染,这个杂峰怀疑是以基因组DNA为模板扩增的产物,让我跑个胶看看,建议购买有去除基因组DNA功能的逆转录supermix,这样可以避免由于基因组DNA的残留,导致的定量不准确。因为实验室以前师兄师姐都没有去基因组的习惯,没想到影响这么大。所以说,祖传的方法不一定可靠,还是要科学学习。多读书,多看说明书,少吃零食少睡觉!

做个实验真不容易,准备工作不到位,结果也是会给你带来“惊喜”!重新逆转录,重新定量,再次看见曲线时,不禁感叹:单峰,真好看!

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