qPCR就是这么任性

去年我一直在跟qPCR、逆转录和SYBRGreen QPCR反应做斗争，其中遇到了不少困难，现在已经告别当初的迷茫。当时在我艰难摸索的时候就想，等我都学会了，我一定要写篇帖子，把当初遇到的一些困难和最后是如何解决这些问题的，写出来，一来可以帮助更多像我这样的人，二来也算让自己有点成就感了。

其中有一次，RNA提取好了，跑完胶3条带非常漂亮，测了浓度有500ng/ul呢，做完逆转录，满怀信心的做QPCR反应，做完发现Ct值偏大，在32以后，最大的能达到38，不能用，很纠结。

于是打电话给vazyme的技术，温柔的技术问了我好多问题，最后发现原因是我把预变性时间设定错了。俗话说，人类最大的错觉就是我以为。

我以为操作都是一样的，按照惯性思维就用以前的程序95℃30s进行预变性的，技术告诉我，不同公司的SYBR Green Mix由于酶的封闭方式不一样，预变性时间不一样，Vazyme的SYBR Green Mix采用的化学修饰的热启动酶，所以预变性时间是95℃5min，低于这个温度，少于这个时间，酶活无法完全释放出来。

弄清楚是这个原因以后，开始后悔自己不认真不仔细，如果早看说明书就不会浪费时间，浪费试剂，浪费样品了，悔！引物、cDNA、Mix混起来，重做，设定好程序，漫长的2个小时，等来的结果却发现扩增曲线挺好的，但是熔解曲线双峰。

Vazyme的技术问我，逆转录的时候有没有去基因组DNA？额，我确实没有去基因组，天呐，难道是这个原因？技术姐姐说，熔解温度这么高，不会是引物二聚体，一般引物二聚体的Tm较小，在75度左右。

有可能是基因组污染，这个杂峰怀疑是以基因组DNA为模板扩增的产物，让我跑个胶看看，建议购买有去除基因组DNA功能的逆转录supermix，这样可以避免由于基因组DNA的残留，导致的定量不准确。因为实验室以前师兄师姐都没有去基因组的习惯，没想到影响这么大。所以说，祖传的方法不一定可靠，还是要科学学习。多读书，多看说明书，少吃零食少睡觉！

做个实验真不容易，准备工作不到位，结果也是会给你带来“惊喜”！重新逆转录，重新定量，再次看见曲线时，不禁感叹：单峰，真好看！