qPCR相关故事
生物学霸
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qPCR 的数据相对定量分析其实很简单。我做了很多的 qPCR 实验,也看了很多的资料,包括 Nature protocol,AB 官方的分析教程,MIQE,甚至包括一些商业化软件使用的教程及教程里面记述的原理。
我在这里跟大家分享一下自己的经验,最常用、最普遍的相对定量方法就是 2^-△△Ct 法。
首先将一次实验的所有基因 Ct 值整理好,之后用每一组样本自身的目的基因 Ct 值减去自身内参基因 Ct 值,得到的数就是 △Ct。换成公式就是:△Ct=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)。
然后,将每一组样本每一个目的基因的 △Ct 都算好,整理进 Excel,用本次实验中待研究样本的 △Ct 减去对照组样本的 △Ct,并同时对所有结果取相反数(就是加一个负运算,正数就变成负数,负数就变成正数),该步运算得到的结果就是 -△△Ct。
最后,对 -△△Ct 进行 2 的幂运算,即 2^-△△Ct 就得出 Fold Change。但是,我想说的是 2^-△△Ct 得出的是 Fold Change,不仅数据结果看上去不直观反应实验组与对照组目的基因 mRNA 的情况,同时还具有放大效应,所谓放大就是本来 A 基因的 -△△Ct 得到为 2,B 基因 -△△Ct 为 4,两者相差 2,经过 2 的幂运算之后,A 基因为 4,B 基因为 16,两者相差 12。
相对定量本身就存在放大的情况,若是再采取 2^-△△Ct 就只能说看看趋势而已了,所以我在这里给大家推荐 ABi 官方的一个分析方法,就是 log2R,就是 log2 为底对 R 求对数。当相对定量分析时,默认扩增效率 E 趋近或等于 100%,这时候 R 就是 2^-△△Ct,当然原本的 R 的公式我会在后面附上,感兴趣的朋友可以自己去推导。
所以,我用的方法就是只计算到 -△△Ct 这一步就够了,这样得到的数据就有了正值与负值,正值表示较对照组 mRNA 上调,负值表示较对照组 mRNA 下调,作出图来非常直观,一目了然,也没有放大效应,显著性分析较为靠谱。这种运算方法最关键的在于负号以及实验组和对照组要分清楚。要不就得到相反的结果。
附上 R 的完整公式: R=(1+E1)^△Ct1(Control-Sample)/(1+E2)^△Ct2(Control-Sample),其中,E1:目的基因引物扩增效率;E2:内参基因引物扩增效率。△Ct1:实验组目的基因 Ct 值差。△Ct2:对照组目的基因 Ct 值差。 你观察这个公式时候就发现,当扩增效率 E 为 1(即 100%)时,该公式就等于 2^-△△Ct,这就是为什么会有 2^-△△Ct 方法的原因。ABi 官网里的一款商业软件能直接给出每次试验每对引物的扩增效率 E,能得到较为实际的 R 值,所以 ABi 的商业软件会对 R 进行 log2 的运算,进而得到直观的结果。
本文作者系丁香园站友 @kainwar3