Southern印迹法检测端粒长度

（1）基因组 DNA 的抽提

A 收集好细胞或组织样品后（约 2.5 x 10⁶ 个细胞），采用 1x PBS 洗涤细胞后，加入裂解缓冲液，在 37 ℃ 孵育 30 min，然后加入 100 μg/mL蛋白酶K 55 ℃ 孵育 4 h，并每小时缓慢混匀 5～10 次。

B 待溶液冷却到室温后，加入等体积的苯酚进行抽提，30 min x 4 次，然后加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）以及氯仿-异戊醇（24:1）进行抽提，然后用 2 倍体积的 100％乙醇-0.1 倍体积 3 mol/L 乙酸钠（pH5.2）沉淀上清液中的 DNA，将絮状沉淀挑出后，用 70％的乙醇洗涤沉淀，室温下干燥 30 min，避免彻底干燥，然后在 4 ℃ 下溶解过夜，并采用紫外分光光度仪测定 DNA 浓度。

（2）制备 32P-标记的端粒探针

A 选用 y-32P-ATP 以末端标记法标记端粒探针（TTAGGG）4，具体探针序列可根据不同物种端粒重复序列进行设计，一般重复 3～4 次。

B 取 100 ng 寡核苷酸（TTAGGG）4，置于 T4 激酶缓冲液中，然后加入 50 μCi y-32P-ATP（1 Ci＝37 GBq），以及 10 U T4 激酶，于 37 ℃ 水浴中孵育 30 min，然后采用 QIAquick Nucle-otide Removal 试剂盒（QIAGEN）纯化探针。

（3）端粒长度及数量检测的 Southern blot 杂交

A 在 2.5 μg 基因组 DNA，加入限制性内切酶Hinf、Rsa I 各 10 U，以及反应缓冲液，置于 37 ℃ 消化过夜

B 测定浓度后，将消化好的 DNA 置于 1％的琼脂糖凝胶中电泳，以 90 V 电压在 1x TBE 中电泳 6 h，然后将凝胶浸入到 0.25 mol/L HCl 中 11～15 min，用水润洗后，将胶浸入 0.4 mol/L NaOH 中 30 min，然后用水将膜浸湿，0.4 mol/L NaOH 平衡 15 min，并以 0.4 mol/L NaOH 通过毛细现象转印法转印 18 h。

C 以 2x SSC 洗涤膜后，用紫外交联仪将 DNA 交联在膜上，并将膜置于杂交瓶中，加入 10 mL 预杂交缓冲液，42 ℃ 反应 2 h。弃去预杂交缓冲液后，将标记好的端粒探针加入到杂交缓冲液中，然后置于杂交瓶中 42 ℃ 杂交过夜。