毛利小五郎的徒弟
首先我的样品浓度未知,我也遵循了原则对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起,但是最后还是内参有条带,但目的基因无条带,
sswei
1、 先配置一个标准样品(B1#)(一般需要检测哪几种离子,就配哪几种离子的混合标准样品),其浓度可为仪器做线性指标时的最大浓度。(如我只需要仪器检测NO3―、SO42―两种离子,做线性时最大浓度对应为20ppm、20ppm,那么(B1#)为NO3―、SO42―两种离子的混合样)
2、 进(B1#),谱图采集完毕后手动停止,修改文件名,保存。按标准样品谱图处理方法对其进行处理(通过调节手动处理按钮、谱图参数表、定量组份表、选择定量方法、定量计算等操作处理),处理完毕保存。再于定量祖份中点击“取校正因子”按钮,此用做水样的定量根据。
3、 连续进同一未知样品三次(W1#),(W2#),(W3#),谱图采集完毕后手动停止,修改文件名,保存。对其进行处理(通过调节手动处理按钮、谱图参数表、定量组份表、定量方法选用“单点校正法”、定量计算等操作处理)。
4、 依次打开(W1#),(W2#),(W3#)谱图的“定量祖份”表,查看计算结果C1#,C2#,C3#,再点击每个谱图中“定量组份表”中的“当前表存档”按钮将他们存档,再点击“取平均表”按钮,会显示一组未知样品浓度CS #1(此结果为粗算值)。保存。
5、 我们再依据CS #1配置标准样品(B2#)。
6、 进(B2#),重复上面2的谱图处理操作。计算完毕后将其定量结果中的校正因子依次粘贴于(W1#),(W2#),(W3#)谱图中定量组份中的校正因子栏,再于定量方法中选取“单点校正法”,定量计算后重复4操作,得到第二组浓度CS #2(此浓度做为未知样品浓度)。保存。
7、 如果需要更精确的结果,重复5、6操作。
可能的原因及建议如下:
(1) 蛋白上样量不足
增加上样量。
(2) 样本中不含目标蛋白
设置阳性对照确定样本中是否含目标蛋白。
(3) 封闭过度
选用合适的封闭液,缩短封闭时间。
(4) 抗体问题
抗体的检测效力太低或失效,或者一抗与组织种属,一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配,换合适的抗体,通过设置对照验证检测系统是否有效。
另外可以增加抗体浓度,延长孵育时间,提高孵育时的温度以改善条带。
(5) 酶失活
直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。
(6) HRP抑制剂干扰
如果使用含有叠氮钠一抗,在一抗孵育后应充分洗膜,之后所用溶液和容器中应避免含有叠氮化钠。
(7) 曝光时间过短
延长曝光时间。
loveliufudan
检测未知浓度的样品通常需要建立一个标准曲线,以便根据样品测量值与标准曲线上相应的浓度值进行对比来确定样品的浓度。标准曲线通常是由一系列已知浓度的标准品所构建的,通过对这些标准品的测量得到一组数据点,然后根据这些数据点建立回归方程,进而预测未知样品的浓度。
在建立标准曲线时,需要注意以下几个方面:
标准品应该涵盖待测样品浓度范围内的一系列浓度,以确保标准曲线的线性范围覆盖待测样品的浓度范围。
在准备标准品时,应该使用与待测样品相同的缓冲液,以确保在测量过程中缓冲液的浓度对结果的影响被最小化。
每个标准品应该至少测量三次,以确保结果的准确性和可重复性。
在你的情况中,如果你已经按照一系列稀释样本的最高浓度做起,但最终目的基因仍然没有条带,可能是因为你的内参对于该实验并不适合。建议重新选择内参基因并再次进行实验。
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