用 PCR 控制基因组 DNA 文库的质量实验

1. 缓冲液、溶液和试剂

ddH₂0

2. 酶和酶缓冲液

10X Vent 缓冲液

Vent DNA 聚合酶

3. 核酸和寡核苷酸

dNTP，各 20 mmol/L

PCR 引物，可以与基因组 DNA 文库克隆位点两侧的载体序列退火

质粒 DNA

4. 特殊设备

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备，包括溴化乙锭，热循环仪

1、在细菌中扩增后，用基因组文库制备的质粒 DNA 建立下列反应。

10~50ng 的质粒 DNA

50pmol 的各引物

5ul 的 10XVent 缓冲液

dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP, 各 0.5ul

1U 的 Vent DNA 聚合酶

用 ddH₂O 定容至 50ul

对下面的每种质粒载体应该分别进行反应：

表达载体，没有文库 DNA 插入

基因组 DNA 文库的混合物

少量 DNA, 由基因组 DNA 文库的单个细菌克隆制备

2、在一个热循环仪中，94°C 将混合物预热 20s。

3、按下面的参数进行 30 轮 PCR 循环。

94°C 15s

55°C 10s（或用引物的合适退火温度）

72°C 40s

将最后一次循环的延伸时间延长至 60s。

4、冷却至 4°C 后，取 25ul 的各反应产物，跑 4% 的琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭染色分析。