基因组DNA文库的建立

一、原理

基因组DNA 文库包括了基因组所有顺序的随机克隆片段。一个好的基因组DNA 文库的大小应足够大，以便包括所有的基因DNA 顺序。DNA 克隆片段也应足够大，其中包括整个基因、连接基因及它们稳定形式所要的侧翼顺序。为了获得高的克隆效率和较大的插入片段，λ噬菌体载体和质粒经常被使用构建基因组DNA

文库。λ噬菌体文库易于操作，噬菌体载体上有多克隆位点。λ噬菌体能容纳10 -50 kb 插入DNA，载体类型应根据所要基因组DNA 片的大小和用途来选择。

构建一个基因组DNA 文库的基本步骤：

① 分离纯化基因组DNA ；

② 切割DNA 成合适大小的片段以用于克隆；

③ 载体DNA 的制备；

④ 把基因组DNA 片段和载DNA 连接；

⑤ 包装重组分子；

⑥ 测定入噬菌体滴度；

⑦ 扩增DNA 文库；

⑧ 评估文的质量。

二、材料

1、培养基

LB 肉汤；LB 琼脂平板；LB 顶层琼脂糖。

2、缓冲液

( 1 ) TSP ：

2 ml 2 mol / L Tris -HCl( pH 7.9 )

10 ml 0.1mol / L 亚精胺

10 ml 0.1mol / L 腐胺

78 ml 水

( 2) DMSO / ATP 溶液：

按顺序加入下述溶液，加ATP 之前需冷却。

85 μl 水

100 μl DMSO（二甲基亚砜）

15 ml 0.1mol / L ATP ( pH7.0)

( 3 ) SMC 溶液：由SMCA 和SMCB 新鲜配制。

( 4) SM 稀释缓冲液：

0.1mol / L NaCl

0.01mol / L MgSO4

0.1 mol / L Tris -HCI ( pH 7.5)

3、试剂和酶

1 ) Bam HⅠ；SauⅠ；NaeⅠ

2 ) T4 DNA 连接酶

3 ）λ噬菌体。

4 ）宿主菌

5 ）对照λDNA

三、实验方案

1、载体λ噬菌臂的制备

λDNA 在噬菌体颗粒中呈线性双链分子，两边带有单链互补末端。大多数λ载体都有独特的多克隆位点。

l ）分离纯化噬菌体DNA

噬菌体DNA 是从单个噬菌斑的液体贮存液分离而来的。通过氯化铯平衡梯度离心中用双显带技术进行大规模噬菌体分离能得到最纯噬菌体。

2 ) Cos 末端的连接（随机）

在剪切λZap 之前，cos 末端一定要连上，保证它们不受降解，并保证cos 末端的完整以便包装。

20 μg DNA

20μl 连接酶溶液

4 weiss 单位 T4 DNA 连接酶

4 ℃ 过夜

65 ℃ 保温15 min 灭活连接酶

3 ）λDNA 臂的消化

按照基因组DNA 降解步骤，λDNA 可被BamHⅠ完全降解。

（1）通过加入以下反应物建立降解反应：

200 μl λDNA ( 20 μg )

25 μl 10×BM 缓冲液A

12.5 μl BamHⅠ( 10U ／μl )

12.5μl NaeⅠ( 10U ／μl )

NaeⅠ 能把填充区域降解成小片段，也可使用其他限制酶。应检查所用载体的酶切图谱以确保所用酶不会降解载体臂。

（2）37 ℃ 反应lh 。

（3）苯酚／氯仿（1∶1 ）抽提一次。被降解的DNA 臂可用琼脂糖凝胶电泳纯化。

（4）加入50μl 8 mol / L 的醋酸铵和300μl 异丙醇。充分混合并离心15min 。

（5）加入0 .5 ml 70 ％乙醇冲洗沉淀并离心2min 。

（6）37 ℃ 干燥沉淀10 min 。

（7）把DNA 悬浮于15 μl TE 缓冲液中，并在0.5 ％琼脂糖凝胶电泳上分析产品。

2、基因组DNA 的部分降解和分级分离

（1）将100 μg 基因组DNA 溶于l×TE 缓冲液中并与50 μlSau3A 酶解缓冲液混合，并加无菌蒸馏水至终体积为500 μl 。

（2）取出其中95μl （标记试管l ) ，并加入Sau3A ( 10U/μl ）。

（3）将余下溶液分成9 管（标记成2-9 ) ，每管50 μl , 10 号管装余下的5 μl。

（4）将1 号管中溶液取出50 μl 至2 号管，混匀后再取出50 μl 至3 号管，如此类推，直至9 号管。

（5）37 ℃ ，酶解反应1h 后，于65 ℃ 下10 min 终止反应。

（6）用0.5 ％琼脂糖凝胶电泳分析DNA 。部分降解DNA 的大小可通过对比1 号管（完全水解）和10 号管（未水解）而给出。

（7）合并部分降解物（3 -8 号管）。

（8）如果需要特定大小的DNA，所有样品都应经0.5 ％琼脂糖凝胶电泳分析，切下胶带提取而获得所要求的DNA 片段。

（9）用苯酚/氯仿（1∶ l ）抽提一次。

（10）乙醇沉淀DNA 。

（11）将DNA 沉淀悬浮于10μl TE 缓冲液中，并于0.5 ％琼脂糖凝胶上分析。

3、λ噬菌臂和DNA 片段的连接

按下述方法建立DNA 连接反应：

2 μl λ噬菌臂（0 . 5 μg /μl )

2 μl 基因组DNA ( 0 . 2 μg /μl )

1μl 10× 连接缓冲液

0.5 μl T4 DNA 连接酶（5 WeissU/μl )

4 . 5 μl 水

轻轻使之混匀并于16 ℃ 反应过夜。

4、包装抽提物的制备

（1）在2L 三角瓶中放入200 ml LB 肉汤和经过夜培养的SMR10 ，初始OD₆₀₀ 为0.02 。34 ℃下充分振荡细胞3h ，直至达到OD₆₀₀ 0. 8 （此步充分振荡是指以325 r / min 旋转摇床）。

（2）将2L 三角瓶移至45 ℃ 条件下，充分振摇15 min。

（3）37 ℃ 下充分振摇三角瓶90 min 。

（4）在冰水中迅速冷却该培养物5 min，不要让温度从这一点再升高，余下的操作均应在冷室中进行。所有需要用的溶液事先需要预冷，所有的试管和工具必须在冰上使用。

（5）4 ℃ 下4000g 离心5 min。尽可能弃去上清液，余下液体用纸吸去。

（6）加入10 ml TSP，轻轻振荡使菌体悬浮。4 ℃ 下4000g 离心5 min，尽可能移去上清液。

（7）加入150 μl TSP ，用玻璃棒轻轻搅拌使菌体沉淀悬浮。

（8）分装悬浮液，每管事先加入5 ml DMSO / ATP 溶液，每管装20μl 悬浮液，轻摇几下，液氮速冻。

5 、带有插人片段的λDNA 体外包装

（1）从液氮中取出一管（20 μl ）包装抽提物。

（2）立即加入10 μl 连接DNA 载体混合物。

（3）握住10s 以熔化该抽提物，用密封的玻璃管搅匀。若有小气泡产生，稍离心一下，以保证所有成分沉于管底。

（4） 28 ℃ 下恒温1. 5h 。

（5）加入500 μl SMC 并混匀。

（6）加一滴氯仿并轻轻旋摇。

（7）离心1 min ，沉降细胞碎片并收集上清。

6、滴定有活力噬菌体颗粒

（1）在100 μl SM 缓冲液中对噬菌体贮存液进行10 倍连续稀释。最终样品浓度相当于0.1 ,0 .01 和0.001 包装反应。

（2）把每个样品和200 μl 铺板细胞混合。

（3）37 ℃ 培养30 min ，让噬菌体颗粒吸附细菌。

（4）加45 ℃ 的3 μl 0.7 ％顶层琼脂糖于每一管中，并立即铺在LB 平板上。

（5）在顶层琼脂糖凝固10 min 后，翻转平板，倒置37 ℃ 过夜。

（6）对每一个平板上的噬菌斑计数，估计文库大小。

（7）以适当噬菌斑密度铺板用以筛选或者通过文库扩增永久保存。

四、注意事项

（1）基因组DNA 应当非常纯，以适应DNA 的酶解，而且基因组DNA 应足够大（超过100 kb ）以获得两个末端的消化产物。

（2）不论是载体DNA 还是靶DNA 不含外源片段是一个基本条件。

（3）在λ噬菌体臂和插入DNA 片段连接过程中有两个重要参数：λ噬菌臂和潜在插入片段的比例；基因组DNA 的浓度和纯度。大约10pg λ噬菌臂和4μgDNA 能产生有效的包装。对一个典型的基因组，要产生一个可表达文库，重组子数一般大于1 ×10⁶ -6× 10⁶ 。

（4）包装抽提物贮存于液氮中，包装效率可保持1 年多，而在-70 ℃ 中只能保存几星期，而且包装效率还会降低。