基因组DNA文库的建立

一、原理

基因组DNA 文库包括了基因组所有顺序的随机克隆片段。一个好的基因组DNA 文库的大小应足够大，以便包括所有的基因DNA 顺序。DNA 克隆片段也应足够大，其中包括整个基因、连接基因及它们稳定形式所要的侧翼顺序。为了获得高的克隆效率和较大的插入片段，λ噬菌体载体和质粒经常被使用构建基因组DNA

文库。λ噬菌体文库易于操作，噬菌体载体上有多克隆位点。λ噬菌体能容纳10 -50 kb 插入DNA，载体类型应根据所要基因组DNA 片的大小和用途来选择。

构建一个基因组DNA 文库的基本步骤：

① 分离纯化基因组DNA ；

② 切割DNA 成合适大小的片段以用于克隆；

③ 载体DNA 的制备；

④ 把基因组DNA 片段和载DNA 连接；

⑤ 包装重组分子；

⑥ 测定入噬菌体滴度；

⑦ 扩增DNA 文库；

⑧ 评估文的质量。

二、材料

1、培养基

LB 肉汤；LB 琼脂平板；LB 顶层琼脂糖。

2、缓冲液

( 1 ) TSP ：

2 ml 2 mol / L Tris -HCl( pH 7.9 )

10 ml 0.1mol / L 亚精胺

10 ml 0.1mol / L 腐胺

78 ml 水

( 2) DMSO / ATP 溶液：

按顺序加入下述溶液，加ATP 之前需冷却。

85 μl 水

100 μl DMSO（二甲基亚砜）

15 ml 0.1mol / L ATP ( pH7.0)

( 3 ) SMC 溶液：由SMCA 和SMCB 新鲜配制。

( 4) SM 稀释缓冲液：

0.1mol / L NaCl

0.01mol / L MgSO4

0.1 mol / L Tris -HCI ( pH 7.5)

3、试剂和酶

1 ) Bam HⅠ；SauⅠ；NaeⅠ

2 ) T4 DNA 连接酶

3 ）λ噬菌体。

4 ）宿主菌

5 ）对照λDNA