甲醇再水化法标记表面分子+胞内分子

甲醇再水化法标记表面分子+胞内分子的相关案例显示在图 4.5B 中，图中人外周血单个核细胞（PBMCs）用不同细胞因子 处理后，同时进行表面分子（CD56 和 CDllb 抗体, 分别是 NK 细胞的标记和 MAC-1 的表达）和 胞内分子（phospho.STAT6）双标记; 然后，根据淋巴细胞亚群信号分子的差异进行设门。

器材：恒温培养箱、离心机等。

试剂：

①1 x PBS（磷酸缓冲液）：称取 1.44 g Na₂HPO₄,0. 24 g KH₂PO₄,8 g NaCl 和 0. 2 g KC1 溶 于 850 mL 双蒸水。用 HC1 校其 pH 至 7.4, 并补足其体积至 1 L, 常温保存。

②胎牛血清（标准细胞培养用血清），4℃ 保存。

③甲醛：4%〜36% 多聚甲醛自制或购买（我们用 16% 多聚甲醛,Electron Microscopy Sciences 公司产品,cat. no. 15710, Washington,PA）。常温保存。

④甲醇。

⑤染色液：1 xPBS,4% FCS, 和 ImM 叠氮纳。4℃ 保存。

⑥ EDTA：制备 5M 储存液，制备 PBS-EDTA 缓冲液应用。EDTA 被用来避免在流式细胞 仪获样过程中形成细胞团。常温保存。

⑦ PBS-EDTA：PBS 和 1 mM EDTA。 常温保存。

甲醇再水化法标记表面分子+胞内分子的基本过程可分为如下几步：

（一）细胞准备

A 细胞培养。按 1×106。细胞/制的细胞量接种于标准组织培养板（6 孔、12 孔和 24 孔）。细胞株常用血清饱和 12 h（时间可不同）。如 Jurkat 细胞尽管是 T 细胞研究的常用模型，但 PTEN 和 SHIP-1 基因缺失导致信号分子主要通过 AKT 和 PI3 激酶效应途径。这种突变使 Jurkat 细胞与初始 T 细胞相比，能在培养时发生细胞增殖，而后者只能在接受外源性刺激后才能增殖。通常, 细胞在高浓度非天然血清中（如牛血清）生长时需要高浓度的生长因子，以提供细胞不能从其天然环境中获得的刺激信号。这样, 它们适应了在非天然环境中生长。在这样的环境中，它们常需要高刺激信号。在这样的条件下，许多信号系统并不反映其基础状态，而背景的活化则变得很明显。在抗体初始滴定时，常用 1 X106 细胞。正确理解某个细胞数的抗体滴度是获得优选信号/噪声比的重要先决条件。其原因是，最佳的抗体浓度和在细胞内结合靶抗原的效力，是反映每个细胞内被结合靶磷酸表位数目、细胞数、非特异性结合阻断剂浓度和能发生背景结合的功能之一。一旦最适条件确定后，细胞数和抗体量也就相应地被确定。如对同样的样本进行多个不同的标记，就有必要对细胞数进行相应放大，以便样本在固定和穿孔后，能被分成几个检测管进行不同染色与处理。

B 加入合适浓度的细胞刺激。除了不刺激/刺激样本外，还要准备对照染色（如同型对照或间标时单独的二抗对照）。再 37℃,15 min。

（二）固定并穿孔

A 直接加入浓缩甲醛溶液于细胞培养物中，使其终浓度达 1%~2%（如用 16% 甲醛溶液，按每样本 l00μL/mL 加入）。漩涡振荡培养板，使细胞均一分布并固定，重新 37℃,15 min。

B 用移液管上下吹打，并使样本细胞完全被移至流式细胞分析管, 冰浴。因其他细胞有固定剂存在，活化细胞更易黏附到塑料上，移液管上下吹打取出大部分这类细胞。通过前后的细胞计数算出丢失的细胞数。通过显微镜观察确定细胞被完全转移，因为培养板中有的地方对于新手来说常会发生明显的细胞丢失。

C 细胞离心（500 g,4℃,5 min）。

D 当细胞以中速漩涡振荡混合时，加入 1 mL 冰冷甲醇到细胞管中，将细胞通透。必须按合理的速率加入甲醇（如 2〜3s/mL）。插入冰中 15 min

E 用 2〜4 mlPBS 洗细胞 3 次，确保将甲醇移去。如甲醇仍然存在，用标记液洗涤常会导致 FCS 蛋白沉淀，要避免这种现象发生。

F 用 500 似的标记液（含 4% FCS 的 PBS）重悬细胞 lh。充分洗涤和再水化可增加人细胞表面抗原表位的可检测性。让我们不能理解的是, 我们在小鼠表面抗原表位的检测中没有发现有何困难。

（三）染色

A 来源于同一刺激条件的刺激细胞需要重新分配以进行不同抗体标记。在标记液中重悬细胞，按每样本 25~100μL 等分细胞。用于抗体标记的细胞浓度应控制在（0.5-1）X106 细胞，并按每样本 25〜100μL 等分。如每标记样本中细胞越少，其在流式细胞仪上的上样时间就越长。因而调整细胞数是很重要的。

B 加入第一抗体至细胞液，孵育 30 min（有的试剂需要孵育更长时间，如 60 min）。通常我们制备一均质的抗体标记液用于所有的样本。这样，如抗体需要 0.1μL/样本，而我们有 10 个样本，我们就按 N + 1 的样本来制备 50μL 终体积。这样所有的样本都可以用同样体积的试剂来标记。

C 用 1 mL PBS 洗细胞两次后，用 l00 μL PBS-EDTA 重悬细胞。如果是第一抗体直接交联荧光基因，你可以马上在流式细胞仪上对样本进行分析。如果是间接标记（如用了第二抗体），继续 D。

D 按预先测定的稀释浓度加入荧光素标记的第二抗体（根据商品推荐浓度或以 1：500~1000 作为开始浓度），作用 15 min。如你要获得最低的非特异性背景标记，还应对样本做单独的二抗对照。还常检测二抗的滴度，以达到对信号的最大区分或鉴别。

E 用 PBS 洗细胞 2 次后，用 100 μL PBS-EDTA 重悬细胞，在流式细胞仪对样本进行分析。

F 调节流式细胞仪的电压，将同型对照或二抗对照控制在较低水平（如低于 101 log 荧光通道）。然后收获未处理样本，并将处理样本与未处理样本做相对比较。有时, 培养条件会人工活化信号系统（这样需要对大多数细胞株进行血清饱和处理）。如前所述, 这将增加未诱导细胞中一些激酶的水平。

F 如上所述，用标记液制备抗体混合液。多颜色标记分析需要不同荧光素结合抗体来做补偿调节。在抗体混合液中，抗体混合液最终体积的 1/5 应该是标记液（含 4% FCS)。如要用较多稀释抗体，抗体混合液终体积可用标记液增加至 100μL。以下用四色标记进行举例。

G 一旦合适的抗体浓度确定后，无论是用于表面分子或胞内分子标记的抗体都可来制备抗体混合液。以下是抗体混合液制备方法举例。
总体积=50μL /1 x 106 细胞
如样本需要 X 体积抗体用量，就要制备 X + 1 体积的抗体用量。
因每样本的终体积是 50μL，所以要用标记液来调整。为确保在染色过程中有阻断试剂, 所需要标记液的最小体积是 10〜15μL。这样如果稀释抗体应用后，有必要时可将标记体积增至 100μL。

H 在 4℃ 冰浴条件下抗体标记 1 h(避光)。

I 用 PBS 洗细胞 3 次，用 100 μL PBS-EDTA 重悬细胞后，流式细胞仪分析。

（四）单步法细胞表面抗原分子标记区分荧光的亮/暗或抗原的中/高度表达

如在甲醇通透时所提及的，该方法的应用可能会引起某些表面抗原表位的丢失（如 CD8 细胞群）及不同表达水平差异的改变（如CDlla,CD45RA,CD62L）；中水平和高水平表达可能会明显下降或严重交叉重叠。另外，在用甲醇或皂素通透后，一步标记法中侧向散射角（SSC）和前向散射角（FSC）特性常不能保持（图 4-4, 第四、五栏）。因为散射特性常用来区分人外周血中不同细胞群（如单核细胞和淋巴细胞），如其发生改变会导致分析上的困难。考虑到这些因素, 我们应用皂素通透相关技术来优化细胞亚群特性。