基于荧光共振能量转移的 HIV-1 病毒的融合分析实验

基于荧光共振能量转移的 HIV-1 病毒的融合分析实验的基本原理是 CCF2-AM 是一种加载于目标细胞内的β内酰胺酶的荧光底物。β内酰胺酶通过酶裂解 CCF2-AM 中的β-内酰胺环从而阻止香豆素与染料的荧光基团间的 FRET。这些裂解改变了 CCF2-AM 从绿色（520nm）到蓝色（447nm）之间的荧光发射光谱，因此可由荧光显微镜、流式细胞术以及紫外光度测定法检测到病毒和细胞间的融合。
异种蛋白可以掺入病毒颗粒，与 Vpr 形成嵌合体。将 BlaM 掺入 HIV-1 病毒后，我们构建了 N 末端联接了 BlaM 的 Vpr 嵌合体。因为 Vpr 结合于 Gag 多聚蛋白质的组分 p6 上，所以 BlaM-Vpr 就会特异性地结合到病毒颗粒上（见注释 4.1）。因为一个细胞中即使少于 100 个的 BlaM 分子，仍能轻易地被检测到，故理论上通过对掺入了几百个 BlaM-Vpr 分子病毒的检测足以检测到单个病毒融合到靶细胞上的信号。 
图 18-1 概述了基于 FRET 测定 HIV 病毒融合的方法。含有 BlaM-Vpr 的 HIV-1 病毒是前病毒 DNA 和 BlaM-Vpr 表达载体共转染的产物。其后用制备好的病毒感染靶细胞。BlaM-Vpr 在融合中的转移通过检测加载于靶细胞中的染料 CCF2-AM 的降解产物来反映。由于融合是应用流式细胞术来分析的，故可以结合免疫染色同时对不同的靶细胞群的亚型进行鉴别。