基于 FRET 的 HIV-1 病毒粒子的融合试验

基于病毒粒子的融合试验分为 3 个步骤：①将含有 BlaM-Vpr 的 NL4-3 导入细胞；②用 CCF2-AM 基质培养细胞用于 Blam 反应；③免疫标记和固定。

器材：96-孔 V 型底培养板（Corning Incorporated，康宁，纽约）、离心机等。

试剂：

①外周血淋巴细胞。

②RPMI 培养液：10％ 胎牛血清，100U／mL 青霉素，和 100 μg／mL 链霉素。

③CCF2-AM 底物和β-内酰胺加载液（PanVera，麦迪逊，威斯康辛州）。

④无 CO₂ 培养基（GibcoTM-Invitrogen 公司，卡尔斯巴德，加州）。

⑤丙磺舒（Sigma，圣路易斯，密苏里州）。

⑥荧光激活细胞分选仪（FACS）染色缓冲液：1x 含 2％ 胎牛血清 PBS，4℃ 保存。

⑦APC 标记的鼠抗人 CD3 抗体，PE 标记的鼠抗人 CD4 抗体，APC-Cy7 标记的鼠抗人 CD8 抗体（BD Biosciences，圣何塞，加州）。

⑧ 16％ 多聚甲醛（电子显微镜科学公司，华盛顿堡，宾夕法尼亚州）

基于 FRET 的 HIV-1 病毒粒子的融合试验的基本过程可分为如下几步：

（一）将含有 BlaM-Vpr 的 NL4-3 病毒粒子导入细胞

A 用 RPMI 培养液洗涤外周血淋巴细胞。

B 计数淋巴细胞并按 2x107 个细胞／mL 种入培养液。

C 将细胞悬液按照 100μl 的等份（2x106 个细胞）加入 v-形底的 96 孔板中，其中包括 4 孔用于基于 FRET 的 HIV-1 病毒颗粒融合检测时免疫染色补偿调节的对照（见小标题（三）)。

D 加入相当于 400ng p24 含有 BlaM-vpr 的 NL4-3 的病毒粒子，37℃ 培养 2 h。

（二）靶细胞加载 CCF2-AM 底物进行的 BlaM 反应

A 根据下述 PanVera 的方案准备 1 mL 的加载溶液。

a．用二甲基亚砜将 CCF2-AM 重悬，配成 1 mM 的贮存液，分成等份贮存于-80℃。

b．用涡旋振荡混合仪将 1 mM CCF2-AM1μl 和 9μl 含 100 mg／mL 的 Pluronic-F127 以及 0.1％ 柠檬酸的液体混合（含 CCF2-AMB 液配方由 PanVera 提供）。

c．加入 1 mL 的无 CO₂ 的培养基再次混匀。

B 配置 1 mL 反应液（2.5 mM 丙磺舒，含 10％ 的胎牛血清的无 CO2 培养基）。

a．将丙磺舒（250 mM）溶于 250 mM 的 NaOH 中配成贮存液，分装后冻存于-20℃。

b．将 10μl 丙磺舒存贮液加到 1 mL 无 CO₂ 培养基中稀释。

c．加入 100μl 胎牛血清。

d. 涡旋震动混匀。

C 室温 800 g 离心 5 min 收集细胞。

D 用 200 μl 的无 CO2 培养基洗涤细胞，于室温 800 g 离心 5 min。

E 100 μl CCF2-AM 加载液重悬细胞沉淀，暗处室温孵育 1 h。

F 室温离心 800 g5 min 收集细胞。

G 用 200μl 的反应液洗细胞，室温 800 g 离心 5 min。

H 用 200μl 反应液重悬细胞沉淀，室温暗处孵育 16 h。

（三）免疫染色与固定

基于 FRET 的 HIV-1 融合试验可以通过免疫染色来确定具体 HIV 病毒感染的细胞群（见注释 4.7），当分析细胞系或已经经过纯化的细胞时此步可以被省略。比如，基于 FRET 的 HIV-1 融合试验后可以用 APC 耦联的抗人 CD3 抗体，PE-Cy7 耦联的抗人 CD4 抗体，APC-Cy7 耦联的抗人 CD8 抗体进行免疫染色。用负载了 CCF2-AM 和上述每种荧光抗体单染的未被感染来作补偿设置。

A 4℃ 离心 800 g 5 min 收集细胞。

B 用 200μl 流式细胞染色缓冲液洗涤。

C 4℃ 800 g 离心 5 min 收集细胞，加 50μl 染色缓冲液，其中含有 1：100 稀释的抗 CD3-APC，1：50 稀释的抗 CD4-PE-Cy7 和 1：50 稀释的抗 CD8-APC-Cy7。对于 4 种补偿对照，用流式染色缓冲液、1：100 稀释的抗 CD3-APC，1：50 稀释的抗 CD4-PE-Cy7；1：50 稀释的抗 CD8-APC-Cy7（见注释 4.8）。

D 4℃ 放置 30 min。

E 4℃ 离心 800 g 5 min 收集细胞。

F 用 200μl 染色缓冲液洗涤细胞 2 次。

G 用 1.2％ 的多聚甲醛 4℃ 固定细胞 2 h。