含 BlaM-Vpr HIV-1 病毒粒子的制备

含 BlaM-Vpr HIV-1 病毒粒子的制备实验讲述的是优化的含 BlaM-Vpr NL4-3 病毒粒子的制备过程。

含 BlaM-Vpr HIV-1 病毒粒子的制备的基本过程可分为如下几步：

（一）用前病毒 DNA，pCMV4-BlaM-Vpr 和 pAdVAntage 转染 293T 细胞转染方法采用磷酸钙 DNA 沉淀法。

A 将悬有 1.5x107 个 293T 细胞的 40 mL DMEM 培养液接种于 T175c㎡组织培养瓶中，于 5％CO₂ 湿度培养箱中 37℃ 培养过夜。

B DNA 沉淀制备

a．准备 1.75 mL 含 60 μg PNL4-3 前病毒 DNA、20 μg。pCMV-BlaM-Vpr 和 10 μg pAdVAn-tage 载体的水（见注释 4.4）

b．缓慢加入 2 mL2xHBS，用移液器上下轻柔吹打混匀。

c．逐滴加入 250μl 的 2M 的 CaCl₂。

d．室温孵育 30 min 沉淀 DNA。

C 用 40 mL 的预温到 37℃ 的 DMEM 溶液换掉培养液。

D 缓慢加入 4 mLDNA 沉淀液，37℃ 作用 16 h。

E 用 40 mL 的 37℃ 预温的新鲜培养液换液。

F 37℃ 放置 24 h。

（二）收获上清液超速离心以浓缩病毒

为了使基于 FRET 的 HIV-1 融合试验有更高的灵活性，病毒必须先用超速离心浓缩（见注释 4.5）。

A 收集转染的 293T 细胞上清液至 50 mL 的离心管中。

B 800 g 离心 10 min 以去除细胞碎片。

C 将 36 mL 的病毒转移入离心管中。

D 将管放入 SW28 转子的离心机中，如有需要，用带 DMEM 的培养液配平。
E 4℃ 连续超速离心（72000 g90 min）。

F 去上清加入 1 mL DMEM，100μl 分装，-80℃ 保存（见注释 4.6）。

（三）用 ELISA 定量检测病毒液中 p246 含量

A p24 含量检测按照试剂说明书进行 ELISA 试验，经过离心浓缩的病毒 p24c 的范围是 20～50 μg/mL。