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含 BlaM-Vpr HIV-1 病毒粒子的制备

相关实验:基于荧光共振能量转移的 HIV-1 病毒的融合分析实验

最新修订时间:

简介

含 BlaM-Vpr HIV-1 病毒粒子的制备实验讲述的是优化的含 BlaM-Vpr NL4-3 病毒粒子的制备过程。

材料与仪器

器材:超净离心管(25 mmx89 mm)(贝克曼设备公司,帕洛阿尔托,加州)、超高速离心机。

试剂:

①pAdVAntage(Promega,麦迪逊,威斯康辛州)。

② pCMV4-BlaM-Vpr(由 Greene 博士惠赠,Gladstone 病毒免疫学研究所,UCSF,旧金山,加州)。

③ pNL4-3 proviral DNA(AIDS Reagent program,NIH,贝塞斯达,马里兰州)。

④ 293T cells(ATCC,马纳萨斯,弗吉尼亚洲)。

⑤ 2xHEPES 缓冲液(HBS):280 mM NaC1,10 mM KC1,1.5 mM Na2HPO4,12 mM 葡萄糖,50 mM。N-(2-羟乙基哌嗪)-N'-(2-乙磺酸)(HEPES),pH7.05,贮存于-20℃。

⑥ 2 M CaCl2

⑦ Dulbecco’s 改良的 Eagle 培养基(DMEM)培养基:DMEM,10% 胎牛血清,100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素。

⑧Alliance HIV-I p24 酶联免疫检测试剂盒(PerkinElmer 生命科学公司,波士顿,马萨诸塞州)。

步骤

含 BlaM-Vpr HIV-1 病毒粒子的制备的基本过程可分为如下几步:

(一)用前病毒 DNA,pCMV4-BlaM-Vpr 和 pAdVAntage 转染 293T 细胞转染方法采用磷酸钙 DNA 沉淀法。

A 将悬有 1.5x107 个 293T 细胞的 40 mL DMEM 培养液接种于 T175c㎡组织培养瓶中,于 5%CO2 湿度培养箱中 37℃ 培养过夜。

B DNA 沉淀制备

a.准备 1.75 mL 含 60 μg PNL4-3 前病毒 DNA、20 μg。pCMV-BlaM-Vpr 和 10 μg pAdVAn-tage 载体的水(见注释 4.4)

b.缓慢加入 2 mL2xHBS,用移液器上下轻柔吹打混匀。

c.逐滴加入 250μl 的 2M 的 CaCl2

d.室温孵育 30 min 沉淀 DNA。

C 用 40 mL 的预温到 37℃ 的 DMEM 溶液换掉培养液。

D 缓慢加入 4 mLDNA 沉淀液,37℃ 作用 16 h。

E 用 40 mL 的 37℃ 预温的新鲜培养液换液。

F 37℃ 放置 24 h。

(二)收获上清液超速离心以浓缩病毒

为了使基于 FRET 的 HIV-1 融合试验有更高的灵活性,病毒必须先用超速离心浓缩(见注释 4.5)。

A 收集转染的 293T 细胞上清液至 50 mL 的离心管中。

B 800 g 离心 10 min 以去除细胞碎片。

C 将 36 mL 的病毒转移入离心管中。

D 将管放入 SW28 转子的离心机中,如有需要,用带 DMEM 的培养液配平。
E 4℃ 连续超速离心(72000 g90 min)。

F 去上清加入 1 mL DMEM,100μl 分装,-80℃ 保存(见注释 4.6)。

(三)用 ELISA 定量检测病毒液中 p246 含量

A p24 含量检测按照试剂说明书进行 ELISA 试验,经过离心浓缩的病毒 p24c 的范围是 20~50 μg/mL。

来源:丁香实验

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