含 BlaM-Vpr HIV-1 病毒粒子的制备

含 BlaM-Vpr HIV-1 病毒粒子的制备实验讲述的是优化的含 BlaM-Vpr NL4-3 病毒粒子的制备过程。

器材：超净离心管（25 mmx89 mm）（贝克曼设备公司，帕洛阿尔托，加州）、超高速离心机。

试剂：

①pAdVAntage（Promega，麦迪逊，威斯康辛州）。

② pCMV4-BlaM-Vpr（由 Greene 博士惠赠，Gladstone 病毒免疫学研究所，UCSF，旧金山，加州）。

③ pNL4-3 proviral DNA（AIDS Reagent program，NIH，贝塞斯达，马里兰州）。

④ 293T cells（ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚洲）。

⑤ 2xHEPES 缓冲液（HBS）：280 mM NaC1,10 mM KC1,1.5 mM Na₂HPO₄,12 mM 葡萄糖，50 mM。N-（2-羟乙基哌嗪）-N＇-（2-乙磺酸）（HEPES），pH7.05，贮存于-20℃。

⑥ 2 M CaCl₂。

⑦ Dulbecco’s 改良的 Eagle 培养基（DMEM）培养基：DMEM，10％ 胎牛血清，100 U／mL 青霉素和 100 μg／mL 链霉素。

⑧Alliance HIV-I p24 酶联免疫检测试剂盒（PerkinElmer 生命科学公司，波士顿，马萨诸塞州）。

含 BlaM-Vpr HIV-1 病毒粒子的制备的基本过程可分为如下几步：

（一）用前病毒 DNA，pCMV4-BlaM-Vpr 和 pAdVAntage 转染 293T 细胞转染方法采用磷酸钙 DNA 沉淀法。

A 将悬有 1.5x107 个 293T 细胞的 40 mL DMEM 培养液接种于 T175c㎡组织培养瓶中，于 5％CO₂ 湿度培养箱中 37℃ 培养过夜。

B DNA 沉淀制备

a．准备 1.75 mL 含 60 μg PNL4-3 前病毒 DNA、20 μg。pCMV-BlaM-Vpr 和 10 μg pAdVAn-tage 载体的水（见注释 4.4）

b．缓慢加入 2 mL2xHBS，用移液器上下轻柔吹打混匀。

c．逐滴加入 250μl 的 2M 的 CaCl₂。

d．室温孵育 30 min 沉淀 DNA。

C 用 40 mL 的预温到 37℃ 的 DMEM 溶液换掉培养液。

D 缓慢加入 4 mLDNA 沉淀液，37℃ 作用 16 h。

E 用 40 mL 的 37℃ 预温的新鲜培养液换液。

F 37℃ 放置 24 h。

（二）收获上清液超速离心以浓缩病毒

为了使基于 FRET 的 HIV-1 融合试验有更高的灵活性，病毒必须先用超速离心浓缩（见注释 4.5）。

A 收集转染的 293T 细胞上清液至 50 mL 的离心管中。

B 800 g 离心 10 min 以去除细胞碎片。

C 将 36 mL 的病毒转移入离心管中。

D 将管放入 SW28 转子的离心机中，如有需要，用带 DMEM 的培养液配平。
E 4℃ 连续超速离心（72000 g90 min）。

F 去上清加入 1 mL DMEM，100μl 分装，-80℃ 保存（见注释 4.6）。

（三）用 ELISA 定量检测病毒液中 p246 含量

A p24 含量检测按照试剂说明书进行 ELISA 试验，经过离心浓缩的病毒 p24c 的范围是 20～50 μg/mL。