流式细胞术筛查酵母菌表面展示文库实验

流式细胞术筛查酵母菌表面展示文库实验的基本原理是酵母菌展示技术平台是由麻萨诸塞州技术学院 Wittrup D. 等建立的，使用 a-凝集素黏附受体显示啤酒酵母菌表面的重组蛋白质。在啤酒酵母菌中，a. 凝集素黏附受体作为黏附分子可以稳定细胞间相互作用, 并可促进配子「a」和α单倍体细胞之间的融合作用。受体由两种蛋白组成，即 Agal 和 Aga2。 Agal 由细胞分泌，与酵母菌细胞壁外层细胞基质的&葡聚糖共价结合。推测 Aga2 是在高尔基体内，通过 2 个二硫键与 Agal 结合, 分泌后仍通过 Agal 附着在细胞上。酵母菌展示系统利用 Agal 和 Aga2 的联合作用在酵母细胞表面展示重组的 scFv, 靶基因克隆到 pYDl 载体（Invitrogen, 卡尔巴斯德，加州），或其具有 AGA2 基因结构的衍生物。所形成的构建体转入含 AGA1 基因染色体整合体的 EBY100 啤酒酵母菌。来自 pYDl 载体的 Aga2 融合蛋白及来自 EBY100 宿主菌的 Agal 蛋白表达均受 GAL1 启动子调控,GAL1 是一种具有严密调控功能的启动子，在缺乏半乳糖时, 不允许任何可测试的 scFv 表达。而在半乳糖诱导下，蛋白 Agal 与融合蛋白 Aga2 在分泌途中结合，已附加表位的 scFv 抗体在细胞表面表达（图 17-1 A,B）。图 17-2 显示 scFv 抗体库的 HA 和 c-myc 的抗原表位标记模式。与 scFv 抗体分子间的相互作用可简单通过将细胞与相关配体一起孵育进行分析（图 17-1c）。图 17-3 显示在一个未免疫的 scFv 基因库中富集和鉴定抗原特异性结合的模式图。一般说来，使用磁珠进行两轮筛选，随后进行两轮流式细胞术分选, 即可以回收到目的克隆（表 17-1）。酵母菌表面展示 scFv 抗体技术还已经被成功用于从独有抗原结合 scFv 克隆产生的小型 (1 X106) 突变基因文库中分离高亲和力的克隆。首先利用错配 PCR 在亲本 SCF 基因中插入 3〜7 个突变点来获得 scFv 高亲和力的变异体来构建突变基因文库。该变异体可通过在酵母菌中呈现的内源性同源重组系统克隆入表面表达载体，称之为缺口修复。缺口修复可利用目的基因和靶位点之间仅 30 个碱基对的同源段即可将基因插入到染色体或质粒的确切位点。这样通过减少与初始亲本克隆相对应的 KD 抗原量来选择群体中抗原结合后最亮的部分,2 周内迅速产生和筛选含 (1 -10) X106 克隆的突变基因库。筛选包括 3〜4 轮的流式细胞术 分选，由于是以已突变克隆为对象的基因库分选，因此流式细胞分选程序与未免疫基因库分选略有不同。