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流式细胞术筛查酵母菌表面展示文库实验

实验分类:

免疫学实验

最新修订时间:

简介

研制重要生物活性分子的亲和性试剂是最重要的,也是生物学家面临的最具挑战性的任务。本章描述了单链抗体可变区基因片段(scFv)酵母菌表面表达文库的建立,这一方法可部分解决该问题。该方法最初由 Feldhaus 等所描述。酵母菌展示技术平台是由麻萨诸塞州技术学院 Wittrup D. 等建立的,使用 a-凝集素黏附受体显示啤酒酵母菌表面的重组蛋白质。酵母菌表面展示 scFv 抗体技术还已经被成功用于从独有抗原结合 scFv 克隆产生的小型 (1 X106) 突变基因文库中分离高亲和力的克隆。目前,用于流式细胞术筛查酵母菌表面展示文库实验的方法主要包括: scFv 表面表达的培养和诱导、Miltenyi 磁珠分选系统 LS 柱进行两轮磁珠分选富集、流式细胞分选前 MACS 柱分离所得细胞的荧光标记、应用流式细胞术从非免疫基因文库中分选抗原特异性 scFv 克隆、克隆确认和亲和力鉴定和分选突变 scFv 文库以获取高亲和力克隆。

原理

流式细胞术筛查酵母菌表面展示文库实验的基本原理是酵母菌展示技术平台是由麻萨诸塞州技术学院 Wittrup D. 等建立的,使用 a-凝集素黏附受体显示啤酒酵母菌表面的重组蛋白质。在啤酒酵母菌中,a. 凝集素黏附受体作为黏附分子可以稳定细胞间相互作用, 并可促进配子「a」和α单倍体细胞之间的融合作用。受体由两种蛋白组成,即 Agal 和 Aga2。 Agal 由细胞分泌,与酵母菌细胞壁外层细胞基质的&葡聚糖共价结合。推测 Aga2 是在高尔基体内,通过 2 个二硫键与 Agal 结合, 分泌后仍通过 Agal 附着在细胞上。酵母菌展示系统利用 Agal 和 Aga2 的联合作用在酵母细胞表面展示重组的 scFv, 靶基因克隆到 pYDl 载体(Invitrogen, 卡尔巴斯德,加州),或其具有 AGA2 基因结构的衍生物。所形成的构建体转入含 AGA1 基因染色体整合体的 EBY100 啤酒酵母菌。来自 pYDl 载体的 Aga2 融合蛋白及来自 EBY100 宿主菌的 Agal 蛋白表达均受 GAL1 启动子调控,GAL1 是一种具有严密调控功能的启动子,在缺乏半乳糖时, 不允许任何可测试的 scFv 表达。而在半乳糖诱导下,蛋白 Agal 与融合蛋白 Aga2 在分泌途中结合,已附加表位的 scFv 抗体在细胞表面表达(图 17-1 A,B)。图 17-2 显示 scFv 抗体库的 HA 和 c-myc 的抗原表位标记模式。与 scFv 抗体分子间的相互作用可简单通过将细胞与相关配体一起孵育进行分析(图 17-1c)。图 17-3 显示在一个未免疫的 scFv 基因库中富集和鉴定抗原特异性结合的模式图。一般说来,使用磁珠进行两轮筛选,随后进行两轮流式细胞术分选, 即可以回收到目的克隆(表 17-1)。酵母菌表面展示 scFv 抗体技术还已经被成功用于从独有抗原结合 scFv 克隆产生的小型 (1 X106) 突变基因文库中分离高亲和力的克隆。首先利用错配 PCR 在亲本 SCF 基因中插入 3〜7 个突变点来获得 scFv 高亲和力的变异体来构建突变基因文库。该变异体可通过在酵母菌中呈现的内源性同源重组系统克隆入表面表达载体,称之为缺口修复。缺口修复可利用目的基因和靶位点之间仅 30 个碱基对的同源段即可将基因插入到染色体或质粒的确切位点。这样通过减少与初始亲本克隆相对应的 KD 抗原量来选择群体中抗原结合后最亮的部分,2 周内迅速产生和筛选含 (1 -10) X106 克隆的突变基因库。筛选包括 3〜4 轮的流式细胞术 分选,由于是以已突变克隆为对象的基因库分选,因此流式细胞分选程序与未免疫基因库分选略有不同。

来源:丁香实验团队

操作方法

scFv 表面表达的培养和诱导

建立单链抗体可变区基因片段(scFv)酵母菌表面表达文库,特异性地设计 scFv 文库,以展示全长 scFv 抗体,该抗体表达在酵母菌细胞表面,可以通过 N. 末端 HA 或 C. 末端 c-myc 抗原决定簇位点标签来监测。这些抗原决定簇位点使利用流式细胞仪检测在表面表达全长 scFv 克隆基因的文库, 或细胞株成为可能。

Miltenyi 磁珠分选系统 LS 柱进行两轮磁珠分选富集

Miltenyi 磁珠分选系统 LS 柱进行两轮磁珠分选富集对 109 多样性的非免疫文库中抗原特异性克隆的富集处理。

流式细胞分选前 MACS 柱分离所得细胞的荧光标记

在每轮筛选前均用抗 HA、抗 c-myc 抗体和第 2 步对照标记文库是非常重要的。这便确立了数个重要基础:①我们的酵母菌正确诱导了吗?②表达 c-myc(即全长 scFv)的比例是多少?③我的二抗试剂有非特异性结合吗?④我们富集的是否是二抗的结合物?如果你打算使用 SA-PE 标记抗原结合细胞,你应当在诱导细胞中加入适当的 SA-PE 看它是否与之结合。GaM 试剂的质控管应当被标记和分析(不加

应用流式细胞术从非免疫基因文库中分选抗原特异性 scFv 克隆

应用流式细胞术从非免疫基因文库中分选抗原特异性 scFv 克隆是从已经过两轮磁珠富集的非免疫性基因文库中分选抗原特异性 scFv 克隆。

克隆确认和亲和力鉴定

克隆确认和亲和力鉴定就是利用 c-myc 的表达来签定先前分选的单个克隆是否真正的抗原结合物。且表达全长 scFv。

分选突变 scFv 文库以获取高亲和力克隆

Boder 等建立了一种产生和分离特定 scFv 的高亲和力突变体方法,这可以通过 scFv 结合解离常数 K,从 nM 到 fM 成熟过程证实。有数种方法可构建突变文库,此处不做叙述。然而,有几条必须遵循的规则。每个克隆发生突变的数量将影响到具有功能的全长 scFv 突变体的数量,同样,它们也会影响亲和力增强的克隆发现的可能性。

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