应用流式细胞术从非免疫基因文库中分选抗原特异性 scFv 克隆

应用流式细胞术从非免疫基因文库中分选抗原特异性 scFv 克隆是从已经过两轮磁珠富集的非免疫性基因文库中分选抗原特异性 scFv 克隆。

器材：恒温培养箱、EP 管等。

试剂：

①YPD 培养基;

②SD＋CAA 培养基;

③XXX。

应用流式细胞术从非免疫基因文库中分选抗原特异性 scFv 克隆的基本过程可分为如下几步：

（一）分选设门设定

从已经过两轮磁珠富集的非免疫性基因文库中进一步分选应可看到抗原结合酵母菌的频率为 1／1000～1／5000，分选设门可选用下列两种方式之一：

A 第 1 种方法的依据是分选最高 0.1％ 的抗原结合细胞，同时也是 c-myc 阳性细胞。它们可能是，也可能不是显而易见或清楚的细胞群体。一般说来，第 1 次分选（第 3 轮筛选）中，从磁柱洗脱下来的所有细胞中的绝大多数均应被分选出来。图 17-5 中，上图中阳性细胞群体是明显的；然而情况并不总是这样（取决于富集比率），有时对抗原结合细胞的分选取决于「信心」。

B 第 2 种方法取决于在抗原存在或缺失时标记相同的亚文库，这时在何处设门将非常明显。图 17-5 下面为一设门举例。

（二）第 1 次分选，第 3 轮筛选

A 将酵母菌分选入含 100μl YPD 培养基的 EP 管，YPD 有助于酵母菌的复苏。在将酵母菌放至选择性培养基生长之前，先在 YPD 培养基培养 1 h。

B 分选后，将细胞接种于合适稀释浓度的含青霉素和链霉素的 SD＋CAA 平皿中。

C 将培养皿在 30℃ 培养 24～48 h。

D 将菌落刮下来收集在一起，在 SD＋CAA 培养基培养数小时。

E 将至少 10X 子文库多样性代表物（决定于分选细胞的稀释平板）用 SG／R＋CAA 进行次代培养。

F 用甘油贮存取自 SD＋CAA 平皿的至少 10X 子文库多样性代表物以防后续步骤需要被重复。甘油贮存是将酵母菌放入 15％ 甘油溶液中并贮存于-80℃。细胞浓度范围可为 1~100 OD600/mL。

（三）第 2 次分选：第 4 轮筛选

这时文库的多样性一般低于 10 万。因此，标记 2x10 酵母菌可 200 倍覆盖多样性。你可以发现约 1％～10％ 的频率结合抗原的克隆，细胞如前标记，所有对照如下。

对照 1：未染色
对照 2：仅标记 GaM-Alexa 488
照照 3：仅标记 SA-PE
对照 4：标记 anti-myc 和 GaM-Alexa 488
对照 5：标记 anti-myc、GaM-Alexa 488 和 SA-PE
样本管：标记 anti-myc／GaM-Alexa 488 和抗原／SA-PE
前述许多照在第 4 轮筛选前诱导 R3 亚文库产物时必须做的。对照 5 有助于鉴别抗原检测试剂特异性结合物和真正的抗原结合物。在双变量点图中至少分析 10 万个细胞才能呈现出细胞分布的图形。通过分选设门以分离仅有 c-myc 阳性和抗原结合细胞，在随后的分选中不含 c-myc 标志的 SA-PE 阳性克隆能被轻易去除。

如果对照 5 中 SA-PE 阳性克隆也为 c-myc 阳性，随后仔细检查针对包含抗原样品的对照 5 可以在双参数图的双阳性象限中发现一个不同的亚群。该细胞群存在于包含抗原样品中而不存在于无抗原对照中，并能被特异性的分离。然而，你可以发现双阳性群体从无抗原对照中的 2％，增加至含抗原样本中的 4％，甚至更多。这些抗原结合物能通过两种方法进行鉴定。第一，在用 SA-PE 分选后，单个克隆随后可进行抗原特异性结合的筛查。分析的克隆数量则取决于对照管 5 与含抗原样品管阳性率的相对差异。第二，用于检测抗原阳性细胞的二抗试剂可改为抗生物素化单克隆抗体或中性亲和素，两者均采用合适的荧光标记。这样可以防止文库中在筛选过程中被与链霉亲和素特异结合克隆污染。对于任何用于检测抗原结合的二抗试剂要确保重复对照 5。

A 如果抗原特异性群体很明显，则采用纯化模式进行分选。分选数百至 1 千酵母菌细胞可足以获得抗原阳性克隆。

B 将酵母菌分选入含 100 μl YPD 培养基的 EP 管。

C 分选后，将细胞接种于含青霉素和链霉素的 SD＋CAA 的培养基中，当酵母菌小于 1000 时，不需要稀释培养基，我们通常获得 50％～80％ 集落形成率。

D 将培养皿在 30℃ 培养 24～48 h。

E 挑取单个克隆转入 SD＋CAA 培养基，我们一般挑取 10 个不同克隆，这些克隆可为完全相同或不同的克隆。特异性克隆的数量将可采用基因测序或 PCR 扩增 scFv 基因-BstN1 指纹图谱法进行检测。

F 取 100μl 转入 1 mL SG／R＋CAA 中进行次代培养。20℃ 培养 16 h 以诱导 scFv 表达。

1 第 1 次流式细胞术分选设门标准并不非常严格，分选速度尽可能慢（重合性中止更少），采用富集模式。缓慢的程度取决于所使用的分选仪。熟练的操作人员应该能够提供相应的指导。