流式细胞分选前 MACS 柱分离所得细胞的荧光标记

在每轮筛选前均用抗 HA、抗 c-myc 抗体和第 2 步对照标记文库是非常重要的。这便确立了数个重要基础：①我们的酵母菌正确诱导了吗？②表达 c-myc（即全长 scFv）的比例是多少？③我的二抗试剂有非特异性结合吗？④我们富集的是否是二抗的结合物？如果你打算使用 SA-PE 标记抗原结合细胞，你应当在诱导细胞中加入适当的 SA-PE 看它是否与之结合。GaM 试剂的质控管应当被标记和分析（不加入抗 c-myc 抗体）。一般来说，我们会看到很少标记，小于 0.1％，也可以偿试其他二抗 ［即中性亲和素、链霉亲和素或抗生物素单克隆抗体（MAb）］ 使二抗非特异性结合物最小程度富集。

器材：恒温水浴锅、离心机等。

试剂：

①抗-HA（12CA5）抗体。

②抗 c-myc 抗体（克隆号为 9E10）（Amersham Biosciences，皮斯卡特维，新泽西州；or Co-vance，Babco，坎伯兰，弗吉尼亚州）；pPNL6 来源基因文库 200 μg／ml；或 pYD1 基因文库抗 V5 单克隆抗体。

③Alexa 488 标记的羊抗鼠（GaM）抗体（Molecular Probes，尤金，俄勒冈州）。

④Alexa 633 标记的羊抗鼠（GaM）抗体（Molecular Probes）。

⑤PE 标记的羊抗鼠（GaM）抗体（Molecular Probes）。

⑥R-PE 标记的链霉亲和素-（SA-PE）（Molecular Probes）。

⑦Alexa 633 标记的链霉亲和素-（SA-633）（Molecular Probes）。

⑧Alexa 647 标记的链霉亲和素-（SA-647）（Molecular Probes）。

⑨异硫氰酸荧光素（FITC）标记的 Neutravidin（NA-FITC）（Molecular Probes）。

⑩PE 标记的中性亲和素-（NA-PE）（Molecular Probes）。

⑪生物素化的纯化抗原，2 μg／kDa 抗原。

⑫青霉素／链霉素，100X 组织培养级（GibcoT Invitrogen 公司）。

⑬洗涤缓冲液／缓冲液：磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），0.5％ 牛血清白蛋白（BSA），和 2 mM EDTA。

流式细胞分选前 MACS 柱分离所得细胞的荧光标记的基本过程可分为如下几步：

A 加 5μl9E10 抗 c-mye 抗体（浓度为 200 μg／mL）到 500μl 含（1～10）x10 酵母菌的磁柱洗脱液中，这时也可加入 100nM 生物素化抗原。但是，如果细胞在磁柱筛选过，应仍有原结合，则不需要加入。

B 冰浴 30 min，高速离心沉淀 10s，再用 500μl 缓冲液洗 2 次。

C 加入 1：200 稀释后的二抗（检测 c-myc 用 GaM-Alexa 488，检测生物素化抗原用 SA-PE）（图 17-4）。

D 冰浴 30 min，离心收集细胞，再用 500μl 用冰预冷的清洗缓冲液洗 2 次。
E 用 1 mL 缓冲液重悬细胞，分选前持续避光冰浴。