【求助】如何确认所得到的序列是转录因子?
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从构建的表达文库中,通过DNA-protein互做调转录因子时,测序得到的片段如何进行分析确认是我想要的转录因子?因为我将得到的转录因子是未知的东西,所以对于拿回的测序结果很茫然不知如何去分析?请高手指点。
请问您是用酵母单杂交的方法拿到的蛋白吗?是否可以找到这个蛋白的基因序列?
拿到蛋白测序结果后,当然是blast一下是否有同源蛋白?那些同源蛋白是否有转录因子?
如果这样都没有结果,可以拿蛋白序列做一个蛋白空间结构的预测,看有没有转录因子元件,如zinc finger等。
其他的方法需要较长的时间,如突变等反向遗传学的方法。
如一个蛋白,人们对它一无所知,那真是一个大发现。好好把握吧!
拿到蛋白测序结果后,当然是blast一下是否有同源蛋白?那些同源蛋白是否有转录因子?
如果这样都没有结果,可以拿蛋白序列做一个蛋白空间结构的预测,看有没有转录因子元件,如zinc finger等。
其他的方法需要较长的时间,如突变等反向遗传学的方法。
如一个蛋白,人们对它一无所知,那真是一个大发现。好好把握吧!
谢谢您的回复!我是用酵母单杂的方法进行筛库的,目前得到很多的基因序列,我在NCBI中进行了blast比对,只找到几个同源蛋白,但都不是转录因子。而且我分析了三十多个序列,有95%以上基本都是刚刚翻译了几十个氨基酸就开始出现终止子了,如果说这是假阳性的话,我觉得这假阳性的概率太高了,我想请教这种现象是怎么回事!之前我的筛选条件也算是比较严紧的了,所以我想是不是我的分析方法有问题?!另外,我想请教的是,您说“拿蛋白序列做一个蛋白空间结构的预测,看有没有转录因子元件”这个我还不太会!我们现在的愿望是筛到一个新蛋白,但是这种情况下我们也很茫然,对于这个新的蛋白要怎样着手进行分析,首先如何确认是个转录因子?请您指点。如果您方便,我的QQ653688175,想详细的向您请教一些问题,不胜感激!!
haichao wrote:
而且我分析了三十多个序列,有95%以上基本都是刚刚翻译了几十个氨基酸就开始出现终止子了,如果说这是假阳性的话,我觉得这假阳性的概率太高了,
这种情况确实很奇怪。蓝斑率大概是多少?一共筛选到多少个克隆?希望楼主可能说得尽可以详细一些。
推荐一篇文章,不知你看过没有:
Eukaryotic Transcription Factors: Identification, Characterization and Functions
http://jn.nutrition.org/cgi/content/full/128/11/2045
http://jme.endocrinology-journals.org/cgi/content/abstract/24/2/203
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1402289
同时可以用 "transcription factor identification or confirmation or predication" 去检索一下相关文献。或者检索“yeast one-hybrid and transcription factor”。
tfscan: Scans DNA sequences for transcription factors
如果你解决了问题,欢迎回来谈谈你是怎么解决的。有奖励。
Eukaryotic Transcription Factors: Identification, Characterization and Functions
http://jn.nutrition.org/cgi/content/full/128/11/2045
http://jme.endocrinology-journals.org/cgi/content/abstract/24/2/203
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1402289
同时可以用 "transcription factor identification or confirmation or predication" 去检索一下相关文献。或者检索“yeast one-hybrid and transcription factor”。
tfscan: Scans DNA sequences for transcription factors
如果你解决了问题,欢迎回来谈谈你是怎么解决的。有奖励。
我当时做单杂时,涂了一百多块板,都是在三缺陷,30mM 3-AT的培养基上进行筛选的,开始筛选时,我是挑取板上的偏大的斑从新在SD/三缺+3-AT的培养基上划板,然后进行半乳糖苷酶显色,均为阳性的再进行菌落PCR,结果在进行PCR时,发现有的半乳糖苷酶显色阳性的菌落PCR后发现并没有插入片段,或者插入片段也很短,这种情况下,我又挑取了半乳糖苷酶显色阴性的菌落进行了PCR,发现有的有插入,而且有的很长,所以,我担心半乳糖苷酶检测会漏掉信息,所以我就在三缺陷+3-AT的培养基上挑取菌落直接进行PCR,然后找长度在700bp以上的插入拿去测序了,测序结果如我上面所述,有95%以上翻译的氨基酸不到几十个就开始出现终止子,而且比对了一下,有些是半乳糖苷酶显色阳性的。到目前,筛选了290个菌斑,菌落PCR鉴定有插入且长度在700以上的有三十多个,拿去测序的结果就这样。现在我想请教高人,帮忙分析一下问题出在何方?然后,我再继续筛选。感谢您的帮忙!感谢版主的支持!
我也很想知道原因!
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