简介
将 ES 细胞注射到四倍体胚胎的囊胚腔，直接获得个体细胞全部来自 ES 细胞的四倍体胚胎互补（tetraploid-embryo.complementation）技术。由于四倍体的细胞在胚胎发育过程中只能参与形成胎盘等胚外组织，而不能形成胚体，而 ES 细胞不能形成胚外组织，因此，注入 ES 细胞后双方可以发生互补，获得的后代胚胎细胞将全部来自 ES 细胞，包括生殖细胞。因此，通过该技术不需进行交配即可证明 ES 细胞的全能性，用于制作转基因动物时也不需进行杂交选育，直接就可以获得转基因动物。
材料与仪器
器材：
① 镊子、离心管、移液管、吸管、培养皿、过滤器
② 37 ℃、5% CO2 的培养箱
③ 倒置相差显微镜（Leica，IMIRB＆DMI 3000）、体视显微镜（Nikon SMZ800）、融合仪（Eppendorf，Multiporator）、显微操作仪（ependorf，NK2）
④ 超净工作台、离心机、盖玻片、擦镜纸、香柏油、
试剂：
① 孕鼠
② PMSG、hCG
③ KSOM、酸性台氏液（acidified Tyrode's solution）
④ DMEM（Invitrogen，10569-010）、Trypsin、Gelatin（Sigma，G1890-100 G）、Mitomycinc（Sigma，0503）
⑤ PBS、70% 乙醇、HEPES ＞ 99.5%（Sigma，H6147）
步骤
四倍体补偿方法得到完全来源于 ES 的嵌合体动物的基本过程为：
1. 四倍体胚胎的准备
① 8～10 周龄成年 CD1 小鼠腹腔注射 10 U 的 PMSG；
② PMSG 注射 48 小时后，腹腔注射 10 U hCG，并与雄鼠合笼；
③ 次日早晨检栓，见栓的小鼠用于收集胚胎；
④ 见栓次日脱臼法处死小鼠，剖开腹腔剥离输卵管，放入含有 HCZB 的 35 mm 培养皿中；
⑤ 用钝头注射器冲洗输卵管，在体视显微镜下收集 2-细胞胚胎，放入预先在培养箱内平衡过夜的 CZB 培养滴中待用；
⑥ 开启融合仪，将融合参数调至 DC 5V，10 s；AC 50 V，35 μs，two cycles，接好融合槽；
⑦ 准备预热的融合液，在 35 mm 皿中做约 100 μl 的 3～4 个滴，将 2 细胞胚胎移入其中，洗涤 3 次，再放入盛有融合液的融合槽中，按「start」，二细胞将自动排列并进行电融合，最终二细胞胚胎将融合成一个四倍体的胚胎；
⑧ 融合胚胎经由 CZB 培养液洗涤 3 次后放入培养滴中，放入 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养；
⑨ 1 小时后观察融合情况，弃去未融合的，融合的胚胎则继续培养至使用；
⑩ 一般在融合后 48 小时，四倍体胚胎将形成囊胚，适于注射。
2. 为四倍体注射提供细胞
① 向 60 mm 培养皿中加入 2 ml 0.1% 明胶，并在 37 ℃ 培养箱中孵育至少半小时；
② 需要检测的 ES 达到传代水平时弃去培养液，用 PBS 冲洗两次；
③ 加入 trypsin，37 ℃ 消化 3～5 分钟，直至细胞卷起；
④ 加入 ES 培养液反复吹吸至成为单个细胞；
⑤ 1200 r/min 离心 5 分钟，去上清，用 3 ml ES 培养液悬浮；
⑥ 将悬浮好的细胞悬液加入凝胶处理的培养皿之上，置于 5% 的 CO2 培养箱中 37 ℃ 孵育 1 小时，这时 feeder 细胞将贴壁于培养皿上；
⑦ 轻轻敲击培养皿，并将悬液转移到 15 ml 离心管中，1200 r/min，离心 5 分钟，弃上清；
⑧ 用 50 μl 的培养液重新悬浮细胞沉淀，将其转入 1.5 ml 离心管中，放在冰上，备用于细胞注射；
⑨ 为保证细胞质量，细胞尽量在 3～4 小时内完成注射。
3. 注射和后续培养
① 准备注射针，持卵针以及显微注射操作滴，在培养皿中放入 1 ml HCZB，用液体石蜡覆盖好；
② 将消化好待用的细胞取 10～20 μl 于 HCZB 操作滴中，把握细胞密度，以细胞与细胞之间留有空隙为好；
③ 在显微镜中挑选扩展的囊胚，然后移到操作滴中；
④ 用持卵针吸取囊胚，调整胚胎位置，使其 ICM 处于 9 点位置；
⑤ 用注射针挑取 10～15 个形态良好（圆形、不太大、表面光滑）的细胞，对准囊胚的两个滋养层之间的位置，通过 peizo 进入囊胚腔，到达囊胚腔中央的位置时慢慢从注射针里吹出 10～15 个细胞，使其进入囊胚腔，尽量让细胞贴近 ICM，小心不要让针碰到 ICM，也不要让任何液体石蜡油滴和死细胞进入囊胚腔；
⑥ 注射完后，慢慢把针从囊胚中抽出，小心不要带出细胞；
⑦ 注射完一批囊胚（10～15 个）后，将注射后的囊胚移到预平衡的 CZB 培养液液滴中，37 ℃、5% CO2 培养箱中培养，等待移植；
⑧ 注射好的胚胎以 10～15 个移到见栓 2.5 天假孕母体子宫中，等待胚胎出生。
来源：丁香实验
